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提供商:         上海研謹(jǐn)生物
服務(wù)名稱:       蛋白雙向2D-WB電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)
規(guī)格:           實(shí)驗(yàn)服務(wù)
價(jià)格：          500元
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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蛋白雙向2D-WB 電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介
2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項(xiàng)技術(shù)

。一般實(shí)驗(yàn)流程為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離,然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上

，再通過抗體雜交顯色。2D-WB技術(shù)可以檢測到抗原等電點(diǎn)或分子量發(fā)生的微小變化

，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)

，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強(qiáng)的抗原。
2D Westerm blot概述
2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項(xiàng)技術(shù)。一般實(shí)驗(yàn)流程為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離

，然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上

，再通過抗體雜交顯色。2D-WB技術(shù)可以檢測到抗原等電點(diǎn)或分子量發(fā)生的微小變化

，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)

，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強(qiáng)的抗原。
2D Western blot技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
1

、蛋白質(zhì)抽提與定量;
2

、雙向電泳;
3、轉(zhuǎn)膜

，封閉

，孵育,顯示成像。
實(shí)驗(yàn)操作流程
1

、第--項(xiàng)電泳(IEF) ,膠條平衡

，第二項(xiàng)電泳SDS-APGE.
2、第二項(xiàng)電泳結(jié)束后

，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜

，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移

。常用的膜是NC膜和PVDF膜

。
3、封閉

，5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(shí)(室溫)或過夜(4度)

。
4、一抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時(shí)間

，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時(shí)或4度過夜

，一抗孵育后取出膜
TBST洗滌3次，每次5分鐘

。
5

、二抗孵育:根據(jù)一抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人

、抗兔等)

，室溫孵育1小時(shí)后取出膜TBST洗滌3次,每次5分鐘。
6

、顯影:將A

、B底物按比例稀釋混臺(tái)均勻后滴在膜上，暗室中將膠片置于膜上,蓋上壓片夾,曝光一定時(shí)間后將膠片放入顯影液中進(jìn)行顯影

，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶

，清水漂洗一下后在定影液中定影，曝光時(shí)間需綜臺(tái)考慮蛋白質(zhì)的上樣量，抗體稀釋濃度

，抗體孵育時(shí)間等因素

。
7、定影后

，清洗膠片

，晾干，標(biāo)定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析

。
送樣須知

，為了保證2D Western blot技術(shù)服務(wù)能順利進(jìn)行,樣品寄送需滿足以下要求:
1、顧客提供:組織

、細(xì)胞

、蛋白質(zhì)溶液等; 一抗(可交由研謹(jǐn)公司代購)。
2

、運(yùn)輸要求:干冰或液氮包裝寄送

。
注:樣本應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融。
2D Western blot技術(shù)服務(wù)報(bào)告內(nèi)容
1

、蛋白質(zhì)定量結(jié)果及電泳上樣量;
2

、原始膠片、電子圖片及圖片分析結(jié)果;
3

、2D Western blot完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告

，包括實(shí)驗(yàn)步驟、使用儀器和試劑等

。
附: 2D Western blot實(shí)驗(yàn)步驟
1

、2D Western blot蛋白質(zhì)樣本制備,制備的主要原則是盡可能溶解全部蛋白質(zhì)，破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用

，避免各類干擾物質(zhì)

，樣品制備與IEF兼容等。
2

、雙向電泳的主要步驟

，第-項(xiàng)電(IEF) ，膠條平衡

，第二項(xiàng)電泳SDS-APGE.
3

、第二項(xiàng)電泳結(jié)束后，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜

，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移

。常用的膜是NC膜和PVDF膜。
4

、封閉

， 5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(shí)(室溫)或過夜(4度)

。
5、-抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時(shí)間

，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時(shí)或4度過夜

，一抗孵育后取出膜TBST洗滌3次，每次5分鐘

。
6

、二抗孵育:根據(jù)-抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人抗兔等)

，室溫孵育1小時(shí)后取出膜TBST洗滌3次

，每次5分鐘。
7

、顯影:將A

、B底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上,暗室中將膠片置于膜上，蓋上壓片夾

，曝光一定時(shí)間后將膠片放入顯影液中進(jìn)行顯影

，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后在定影液中定影

，曝光時(shí)間需綜合考慮蛋白質(zhì)的.上樣量

，抗體稀釋濃度，抗體孵育時(shí)間等因素

。
8

、定影后，清洗膠片

，晾干

，標(biāo)定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。

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、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色

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