服務(wù)名稱: 酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
規(guī)格: 實(shí)驗(yàn)服務(wù)
價(jià)格: 1500元
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
歡迎咨詢?cè)斦?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">,我們?huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議
。
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酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 技術(shù)概述:
酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè),英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù))
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酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 技術(shù)概述:
酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè),英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù))
, 能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理
,一句話概括就是:用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子
,并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來。
1、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作
(1)設(shè)備與耗材:
①超凈工作臺(tái);
②5% CO2 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱;
③P20
斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn).gif)
1、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作
(1)設(shè)備與耗材:
①超凈工作臺(tái);
②5% CO2 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱;
③P20
,P200, P1000 微量移液器,
④P300 8通道微量移液器
④P300 8通道微量移液器
,P300 12通道微量移液器,
⑤Biosys ELISPOT Reader
⑥P20,P200
⑤Biosys ELISPOT Reader
⑥P20,P200
, P1000 槍頭;
⑦多道移液器吸槽;
⑧0.5mL, 1.5mL EP管
⑦多道移液器吸槽;
⑧0.5mL, 1.5mL EP管
。
(2)溶液配制
①PBS:用分析純?cè)噭?div id="m50uktp" class="box-center"> ,Millipore級(jí)別的純水配制
(2)溶液配制
①PBS:用分析純?cè)噭?div id="m50uktp" class="box-center"> ,Millipore級(jí)別的純水配制
, 高壓滅菌。
②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作
②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作
。儲(chǔ)存于20-25°C, 可存放一個(gè)月
。
③70%乙醇:分析純乙醇70mL
③70%乙醇:分析純乙醇70mL
,加入Millipore級(jí)別的純水至100mL
。
④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級(jí)別的純水至100mL.
⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解
④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級(jí)別的純水至100mL.
⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解
。使用時(shí)
,用PBS稀釋50倍,每孔50uL
。
⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲(chǔ)液(Blocking stock solution R)稀釋10倍,每孔200uL
⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲(chǔ)液(Blocking stock solution R)稀釋10倍,每孔200uL
。
⑦抗體稀釋液:注意
⑦抗體稀釋液:注意
,只是用來稀釋檢測(cè)抗體和酶聯(lián)親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲(chǔ)液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍
⑧檢測(cè)抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書
⑧檢測(cè)抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書
, 加入雙蒸水溶解
。使用時(shí),用抗體稀釋液稀釋100倍
,每孔100uL
。
⑨酶聯(lián)親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解
⑨酶聯(lián)親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解
。使用時(shí),用抗體稀釋液稀釋100倍,每孔100uL。
D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書, 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲(chǔ)存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝,-200C保存。
使用時(shí),解凍,每孔加入100pL.
①PHA刺激物:將儲(chǔ)存液(2mg/ml,Murex)分裝成20μL/EP管, -20*C長(zhǎng)期凍存。 使用時(shí),加入980μLU-Cytech無血清培養(yǎng)基(或者1640基本培養(yǎng)基),成為工作液(40μg/mL,10倍終濃度),每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。
②U-Cytech無血清培養(yǎng)基:我們推薦無血清ELISPOT技術(shù),它能排除血清的干擾,結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,背景也更好。如果沒有,可以用含10%血清的1640培養(yǎng)基代替。
2
D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書, 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲(chǔ)存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝,-200C保存。
使用時(shí),解凍,每孔加入100pL.
①PHA刺激物:將儲(chǔ)存液(2mg/ml,Murex)分裝成20μL/EP管, -20*C長(zhǎng)期凍存。 使用時(shí),加入980μLU-Cytech無血清培養(yǎng)基(或者1640基本培養(yǎng)基),成為工作液(40μg/mL,10倍終濃度),每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。
②U-Cytech無血清培養(yǎng)基:我們推薦無血清ELISPOT技術(shù),它能排除血清的干擾,結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,背景也更好。如果沒有,可以用含10%血清的1640培養(yǎng)基代替。
2
、ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序
(1)第—天: ELISPOT包被程序設(shè)計(jì)好試驗(yàn)
(1)第—天: ELISPOT包被程序設(shè)計(jì)好試驗(yàn)
,把每個(gè)孔要加入的內(nèi)容做成卡片,到時(shí)候就會(huì)從容很多
。每孔加入15μL 70%的醇預(yù)濕30秒
。
注意:
①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的
注意:
①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的
,經(jīng)過乙醇潤濕之后
,顏色變暗,變成半透明狀
,很容易觀察二者的區(qū)別
。
②加乙醇的時(shí)候,槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方,注意槍頭不到刺到PVDF膜。
③有時(shí)候,加入的乙醇掛在孔壁上, 這時(shí)要蓋上板蓋,輕輕叩擊,讓乙醇順勢(shì)滑落。乙醇一 旦接觸到PVDF膜,就會(huì)在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤整塊膜,使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。
④15μL 是經(jīng)過優(yōu)化的體積,它能保證剛好完全浸潤整塊膜,而不會(huì)有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就會(huì)透過膜而積存在膜的背面,加深實(shí)驗(yàn)的背景。
⑤加入100μL去離子水洗滌三次,盡量減少乙醇的殘留。
⑥按照試劑盒的使用說明,將包被抗體儲(chǔ)存液稀釋在PBS緩沖液中,每孔加入50μL,4°C包被過夜。
⑦(次日)傾倒包被液,用PBS洗滌5次,最后一次,在滅菌的吸水紙上扣干。
⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液,37°C封閉1小時(shí)。
⑨傾倒封閉液,無須洗滌,直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存數(shù)周
②加乙醇的時(shí)候,槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方,注意槍頭不到刺到PVDF膜。
③有時(shí)候,加入的乙醇掛在孔壁上, 這時(shí)要蓋上板蓋,輕輕叩擊,讓乙醇順勢(shì)滑落。乙醇一 旦接觸到PVDF膜,就會(huì)在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤整塊膜,使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。
④15μL 是經(jīng)過優(yōu)化的體積,它能保證剛好完全浸潤整塊膜,而不會(huì)有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就會(huì)透過膜而積存在膜的背面,加深實(shí)驗(yàn)的背景。
⑤加入100μL去離子水洗滌三次,盡量減少乙醇的殘留。
⑥按照試劑盒的使用說明,將包被抗體儲(chǔ)存液稀釋在PBS緩沖液中,每孔加入50μL,4°C包被過夜。
⑦(次日)傾倒包被液,用PBS洗滌5次,最后一次,在滅菌的吸水紙上扣干。
⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液,37°C封閉1小時(shí)。
⑨傾倒封閉液,無須洗滌,直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存數(shù)周
。)
(2)第二天:鋪細(xì)胞
(2)第二天:鋪細(xì)胞
,加入刺激物,培養(yǎng)
①整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置-組正對(duì)照(PHA刺激), 每一個(gè)細(xì)胞樣品(同-個(gè)捐獻(xiàn)者或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)要設(shè)一個(gè)負(fù)對(duì)照
(不加刺激物)
①整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置-組正對(duì)照(PHA刺激), 每一個(gè)細(xì)胞樣品(同-個(gè)捐獻(xiàn)者或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)要設(shè)一個(gè)負(fù)對(duì)照
(不加刺激物)
,整塊板還要加一個(gè)背景負(fù)對(duì)照(不含細(xì)胞,只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑)
。
②填好實(shí)驗(yàn)卡片
②填好實(shí)驗(yàn)卡片
,用以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的安排和細(xì)胞及試劑的添加。每一個(gè)細(xì)胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個(gè)孔的重復(fù)(想要有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義,每個(gè)細(xì)胞/刺激物設(shè)4個(gè)孔的重復(fù))。
④取出封閉好的板,準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前做的封閉,可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養(yǎng)基,室溫靜置10分鐘,傾倒,然后再重復(fù)- -次。
⑤按照實(shí)驗(yàn)卡片的安排,加入不同濃度的細(xì)胞,100uLwell, 細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入
細(xì)胞之后,不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞更分散,實(shí)際情況剛好相反)。正對(duì)照的細(xì)胞濃度為1x105/well,實(shí)驗(yàn)組的樣品細(xì)胞濃度請(qǐng)自行調(diào)整。
⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對(duì)照孔。
⑦正對(duì)照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌。
⑧加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物(配制成10X終濃度,10uLwell)到實(shí)驗(yàn)孔。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓刺激物在孔中混合均勻,實(shí)際上,通過擴(kuò)散
④取出封閉好的板,準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前做的封閉,可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養(yǎng)基,室溫靜置10分鐘,傾倒,然后再重復(fù)- -次。
⑤按照實(shí)驗(yàn)卡片的安排,加入不同濃度的細(xì)胞,100uLwell, 細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入
細(xì)胞之后,不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞更分散,實(shí)際情況剛好相反)。正對(duì)照的細(xì)胞濃度為1x105/well,實(shí)驗(yàn)組的樣品細(xì)胞濃度請(qǐng)自行調(diào)整。
⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對(duì)照孔。
⑦正對(duì)照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌。
⑧加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物(配制成10X終濃度,10uLwell)到實(shí)驗(yàn)孔。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓刺激物在孔中混合均勻,實(shí)際上,通過擴(kuò)散
,刺激物也會(huì)很快混合均勻。拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞成圈的分布在孔的外周
。
⑨當(dāng)加完所有的樣品之后
⑨當(dāng)加完所有的樣品之后
,蓋上板蓋
,放入二氧化碳培養(yǎng)箱
,37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。 注意在整個(gè)培養(yǎng)過
程中避免移動(dòng)
程中避免移動(dòng)
、碰撞培養(yǎng)板
。為了取得更好的結(jié)果,甚至開關(guān)培養(yǎng)箱的箱[ ]也應(yīng)該禁止
。因?yàn)榕鲎矔?huì)造成細(xì)胞的移位,造成斑點(diǎn)的模糊
、拖尾
。
(3)第三天:培養(yǎng)后操作
①傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。
②低滲法將細(xì)胞裂解,每孔加入200μL冰冷的去離子水
(3)第三天:培養(yǎng)后操作
①傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。
②低滲法將細(xì)胞裂解,每孔加入200μL冰冷的去離子水
,將板置于冰上冰浴10分鐘
。
③每孔用200μLPBST洗滌10遍
③每孔用200μLPBST洗滌10遍
,洗滌最后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干
。
④按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋檢測(cè)抗體
④按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋檢測(cè)抗體
,每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體,37°C 1小時(shí)
。
⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍,洗滌最后一遍時(shí)
⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍,洗滌最后一遍時(shí)
, 將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下,同時(shí)洗滌膜的正反兩面
,蓋上保護(hù)層,將板倒扣在吸水紙上拍干。
注意:
①洗滌膜的背面,我們摸索出的辦法是,在-個(gè)淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入,輕輕搖晃幾次即可。注意
注意:
①洗滌膜的背面,我們摸索出的辦法是,在-個(gè)淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入,輕輕搖晃幾次即可。注意
,-定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后
,再合攏,蓋上
,不要傷害到膜
。
②按照試劑盒說明的濃度
②按照試劑盒說明的濃度
,用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素
,每孔加入100L, 37°C 1小時(shí)。
③每孔用200μL PBST洗滌5遍
③每孔用200μL PBST洗滌5遍
, 洗滌最后-遍時(shí)
,將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下,同時(shí)洗滌膜的正反兩面
,蓋上保護(hù)層,將板倒扣在吸水紙上拍干
。
④照試劑盒的說明
④照試劑盒的說明
,解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液
,室溫靜置20-30分鐘
,注意避光。
⑤待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到適合的大小之后
⑤待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到適合的大小之后
,以去離子水洗滌2遍
,終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上,拍干細(xì)小的水珠
,之后取下保護(hù)層
,放在通風(fēng)的地方,室溫靜置10-30分鐘
,讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內(nèi)
,防止膜發(fā)脆
、破裂。
⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi),調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)
⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi),調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)
,半點(diǎn)計(jì)數(shù),并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)
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