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提供商:         上海研謹(jǐn)生物
服務(wù)名稱:       NF-KB p65活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
規(guī)格:           實(shí)驗(yàn)服務(wù)
價(jià)格：          200元
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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NF-KB p65活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB (NF-kB) 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種與炎癥

、抗凋亡

、
腫瘤形成和轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因表達(dá)。NF- kappaB (NF _kB)最初被鑒定為在B細(xì)胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強(qiáng)子結(jié)合

。但隨后在非B-細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)

，形成NF-KB和kB的復(fù)合物。最初在DNA結(jié)合蛋白復(fù)臺(tái)物中分離的NF -kB是由p65(ReIA)和p50構(gòu)成的異源雙聚體

。其他分離的單體包括p49 (也可稱為p52) , p75 (C-Rel) ,p68(ReIB)

。 p65,p68，p75單體起反式激活作用

。p50, p49 (p52) 單體具有DNA結(jié)合活力

，但只具有微量的反式激活作用。據(jù)報(bào)道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉(zhuǎn)錄活力的異源雙體

，類似于p50/ p65異源雙體

。p49/ p65和p50/ p65異源雙體在細(xì)胞質(zhì)中受一種叫kBa/MAD-3的抑制劑調(diào)節(jié)。

IkB和p65單體結(jié)合

，阻制了細(xì)胞核中的定位和DNA的結(jié)合

。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA微弱地結(jié)合

。Poly(dl:dC)能抑制這一反應(yīng)

。p49和p50也能形成同源雙聚體，但在細(xì)胞中的濃度很低

。通常,在作NF-KB的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時(shí),在20ul的反應(yīng)體積中

，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles的NF -kB9寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCI, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油

，0.05%NP-40。當(dāng)用純化的蛋白時(shí)

，250-300ng足以形成凝膠遷移復(fù)合物

，而需用10ug的Hel a細(xì)胞核抽提物。凝膠遷移復(fù)合物在室溫中保溫30分鐘

，在50mMTris(pH8 3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復(fù)合物

。含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)色素的加樣溶液只能加入到陰性對(duì)照反應(yīng)中，因這兩種色素會(huì)加劇NF-kB復(fù)合物的解離

。當(dāng)用Hel a細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白來(lái)源時(shí)

，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復(fù)合物，即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體

。在表達(dá)p49

，p50, p65的細(xì)胞中，可檢測(cè)到4個(gè)序例特異的凝膠遷移復(fù)合物(p49/ p49

，p50/ p50

，p50/ p65，p49/ p65)

，如果存在高濃度的p65

，可檢測(cè)到微量的p65/p65.

下列試劑可加強(qiáng)NF- kB在體外的結(jié)合: mM的GTP, ATP, 精胺，亞精胺,鋇或鈣離子

，ng的
Co+3(NH3)6 (12)

。提取組織或細(xì)胞核蛋白，利用不同形式的NF -Kb p65抗體捕獲細(xì)胞核蛋白并加以區(qū)分,通過(guò)酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與NF -Kb p65吸光度值

，進(jìn)行定量比較,從而明確目的蛋白的活化度

。

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