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提供商:         上海研謹(jǐn)生物
服務(wù)名稱:       真核表達(dá)載體構(gòu)建實驗服務(wù)
規(guī)格:           實驗服務(wù)
價格：         3000元
收費標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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真核表達(dá)載體構(gòu)建實驗服務(wù)

一.服務(wù)介紹
分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法

。常含有目的基因,用體外重組方法將它們插入克隆載體

，形成重組克隆載體,通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴增

，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體

，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增

。

二

、實驗原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組

，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+

、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中

，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種: T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶

。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在--起的功能

，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來

。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低

，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步:首先

，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶- AMP復(fù)合物;然后,酶一AMP復(fù)臺物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上

，使DNA腺苷化;最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來

。
DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法

，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服

。
連接反應(yīng)的溫度在37°C時有利于連接酶的活性但是在這個溫度下

，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度

，即12-16°C

，連接12-16h(過夜), 這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定

。

三

、實驗流程
1.目的DNA的擴增和純化;
2.連接反應(yīng);
3.電泳檢測連接產(chǎn)物。

四

、客戶提供
樣本DNA

，基因序列,試劑盒。

五

、公司提供
構(gòu)建好的載體

，電泳膠圖，測序結(jié)果

。

從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域

、生物醫(yī)學(xué)實驗外包及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實驗服務(wù)及論文潤色

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