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提供商:         上海研謹(jǐn)生物
服務(wù)名稱:       基因克隆服務(wù)
規(guī)格:           實(shí)驗(yàn)服務(wù)
價(jià)格：        2000元
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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基因克隆

一.目的基因的獲得
目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因,也就是將要克隆或表達(dá)的基因

。獲得目的基因是分子克隆過程中最重要的一步

。目前用于獲得目的基因的方法有幾種，如限制性內(nèi)切酶直接分離法

、文庫篩選法

、體外擴(kuò)增法和人工合成法等，其中限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 或逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 體外擴(kuò)增目的DNA--片段是目前zui常用的方法

。

(一)采用限制性酶切法直接分離目的基因
1

、從原核基因組中制備原核基因組相對較小，用幾種限制性內(nèi)切酶分別消化原核基因組

，或用某種限制性內(nèi)切酶對所要研究的基因組進(jìn)行部分消化

，可以得到大小不等的各種片段，其中有些片段就會(huì)含有目的基因

，將這些片段插入載體中進(jìn)行克隆

，經(jīng)過篩選，可以得到所需的目的基因

。
2.從真核基因組中制備真核基因組比較大

，直接用限制性內(nèi)切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多

，不易操作?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">？梢杂靡环N限制性內(nèi)切酶先消化基因組DNA,產(chǎn)生連續(xù)的DNA--片段

，然后電泳分離這些DNA--片段，再用-段特異探針與這些DNA--片段進(jìn)行雜交

，在含有特異性模板的區(qū)域就會(huì)出現(xiàn)雜交帶

，可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA--片段全部克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中

，制成基因組文庫

，再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進(jìn)行雜交，陽性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列

。將陽性克隆測序

，用第--個(gè)克隆片段的末端分離下一個(gè)克隆片段，然后利用DNA--片段間的重疊順序來鑒定其他克隆

。這樣一步步走下去

，最終可得全部基因序列，這種技術(shù)叫做染色體步移(chromosome walking)

。

(二)采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因
1.根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物

，采用PCR (以基因組DNA為模板)或RT-PCR (以mRNA為模板)從組織或細(xì)胞中獲取目的基因片段用于基因操作，這是實(shí)驗(yàn)室中zui常用的獲取已知基因的方法

。
2.利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以根據(jù)需要在引物序列上設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)起始密碼子或終止密碼子等

，或通過人為錯(cuò)配改變堿基序列(人工突變)對目的基因進(jìn)行有限修飾。對于未知基因

，可采取構(gòu)建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設(shè)計(jì)共用引物

，將所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然后采用一對共用引物擴(kuò)增所有cDNA--片段，將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的片段插入到適當(dāng)載體中

，構(gòu)建成PCR-CDNA文庫

。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將表達(dá)水平很低的mRNA擴(kuò)增出來，有利于篩選出表達(dá)豐度低的基因

。由于經(jīng)過PCR擴(kuò)增

，基因序列的精確性需要采用其他方法進(jìn)一步確定。
3.還有一個(gè)獲得目的基因的方法是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)克隆

。即利用GenBank中的基因信息

，通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性)，利用保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物

，再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細(xì)胞中獲取未知的基因片段

。這是目前可實(shí)現(xiàn)的一種獲得新基因的捷徑。
(三)基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選
1.將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化后插入到適當(dāng)載體中

，得到含有不同插入片段的克隆載體

，這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段

，這就是基因文庫。若將細(xì)胞內(nèi)所有mRNA均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后將所有cDNA--片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中

，構(gòu)建成含有不同cDNA--片段的克隆載體混合物

，這就是cDNA文庫。目前許多組織或細(xì)胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買到

。
2.當(dāng)獲得了基因組文庫或cDNA文庫

，可以根據(jù)已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段

，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段

。基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和使用請參見本書相應(yīng)的章節(jié)

。

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