大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)
MaxiGel Extraction Kit
貨號(hào): K0518
保 存: 室溫
組分說(shuō)明
Cat.No. K0518
KitSize 50
BufferPG 100ml
BufferPS 15ml
BufferPW(concentrate) 10ml
BufferEB 10ml
SpinColumnDL 50
CollectionTube(2ml) 50
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒采用新型硅基質(zhì)膜技術(shù),通過(guò)快速
,簡(jiǎn)單的結(jié)合-洗滌-洗脫步驟可從大量普通或低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收純
化 50bp-50kb 的 DNA 片段,溶膠速度快
,每個(gè)吸附柱最高可吸附 30 μg 的 DNA
,純化過(guò)程中有效去除引物、核苷酸
、
酶
、礦物油、瓊脂糖等雜質(zhì)
,獲得高純度
,完整性好的 DNA 片段,回收率高達(dá) 90%
。本試劑盒回收純化的 DNA 可直接用
于測(cè)序
、連接和轉(zhuǎn)化
、酶切
、標(biāo)記、體外轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
。
注意事項(xiàng)
1..第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明在BufferPW中加入無(wú)水乙醇
。
2.使用前請(qǐng)檢查BufferPG是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀,如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象
,可在37℃水浴幾分鐘
,即可恢復(fù)澄清。
3.電泳時(shí)最好使用新的電泳緩沖液
,以免影響電泳和回收效果
。
4.切膠時(shí),紫外照射時(shí)間應(yīng)盡量短
,以免對(duì)DNA造成損傷。
5.回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關(guān)
。
6.所有離心步驟均為使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心
。
自備:無(wú)水乙醇,離心管
操作步驟
1. 將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分)
,放入干凈的離心管(自備)中
,稱取重量
。
注意:若膠塊的體積過(guò)大
,可將膠塊切成碎塊。
2. 向膠塊中加入3倍體積Buffer PG
;當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度>2%時(shí)
,建議使用6倍體積BufferPG(如凝膠重為100mg
,其體積可視為100μl
,依此類推)。
3. 50℃孵育10分鐘
,其間不斷溫和地上下顛倒離心管
,以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊
,可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘,直至膠塊完全溶解
。
注意:1)在膠充分溶解后檢測(cè)pH值
,若pH值大于7.5,可向含有DNA的膠溶液中加10-30μl 的3M醋酸鈉(pH5.0)將pH值調(diào)到5-7
。
2)膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱
,因?yàn)槲街谳^高溫度時(shí)結(jié)合 DNA 的能力較弱
。
4.(可選步驟)當(dāng)回收片段<500bp或>4kb時(shí)
,應(yīng)加入1倍膠體積的異丙醇,上下顛倒混勻(如凝膠為100mg
,則加入100μl異丙醇)
。
注意:當(dāng)回收片段為500bp-4kb時(shí)
,加入異丙醇不會(huì)影響回收率
。
5.柱平衡:向已裝入收集管(CollectionTube)中的吸附柱(SpinColumnDL)中加入200 μl Buffer PS,12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘
,倒掉收集管中的廢液
,將吸附柱重新放回收集管中。
6.將步驟3或者步驟4所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中
,室溫放置2分鐘,12,000rpm離心1分鐘
,倒掉收集管中的廢液
,將吸附柱放回收集管中。
注意:吸附柱容積為700μl
,若樣品體積大于700μl 可分批加入
。
7.(可選步驟)向吸附柱中加入500μlBufferPG
,12,000rpm離心1分鐘
,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中
。
注意:如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)用于直接測(cè)序
、體外轉(zhuǎn)錄或顯微注射,推薦用此步驟以除去所有凝膠
。
8. 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇),12,000rpm離心1分鐘
,倒掉收集管中的廢液
,將吸附柱放回收集管中。
9. 注意:如果純化的DNA用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)(例如平末端連接或直接測(cè)序)
,建議加入BufferPW靜置2-5分鐘再離心
。12,000rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液
。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘,以徹底晾干
。
注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除
,乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)
。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響
,建議將吸附柱開(kāi)蓋,置于室溫放置數(shù)分鐘
,以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇
。
10. 將吸附柱放到一個(gè)新離心管(自備)中,向吸附膜中間位置懸空滴加100 μl Buffer EB(pH 8.5)
,室溫放置2分鐘
。12,000rpm離心2分鐘,收集DNA溶液
。-20℃保存DNA。注意:1) 洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響
。若用水做洗脫液
,應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)。
2) 為了提高DNA的回收量
,可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中
,重復(fù)步驟10
。
3) 洗脫體積不應(yīng)小于50μl
,體積過(guò)少會(huì)影響回收效率。
4) 如果使用TE洗脫
,需要考慮其中含有的EDTA是否會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)
。
5)回收大于10kb的DNA片段時(shí),BufferEB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱
,適當(dāng)延長(zhǎng)吸附和洗脫時(shí)間,可增加回收效率
。
從2011年開(kāi)始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域
、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤(rùn)色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤(rùn)色
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