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• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中
  ，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞

  。

 

• 250g
  ，離心 10min。

 

• 棄上清
  。

 

• 用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞
  。

 

• 250g，離心 10min
  。

 

• 重復(fù) 7
  、8、9
  ，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞
  。

 
分離圖例：
 
 
 
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
 
（1）用內(nèi)皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：TBD20180011）或內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)
 
品編號：TBD20180051）以 1.5-3×10⁶ 個/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞
 
板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。
 
（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
 
（3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
 
注：
 

• 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分
  ，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清
  。

 

• 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

 

• 由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的
  ，此法成本相對較低
  。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰

性分選。
 
【注意事項】
 

• 全過程樣本
  、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行

  。為獲得最佳的實驗結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進行實驗

  ，樣品存放時間越長

  ，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的

  。

 

• 本實驗最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
  ，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品

  ，因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁

  、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果

  。

 

• 吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加
  。

 

• 如所實驗后細(xì)胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助
  。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
 
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
 
【參考值（參考范圍）】
 
本實驗內(nèi)皮細(xì)胞提取率大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進行參考。
 

	紅細(xì)胞		白細(xì)胞		血小板
		（4.0-10.0）×109
含量（個/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×1011
		50%-70%	20%-40%	3%-8%

 
【可能存在的問題及解決方法】
 

• 由于血液粘度或其他個體差異
  ，可能會造成以下兩種情況：a：離心后細(xì)胞在上層的血漿層中或稀釋液層中，是由于轉(zhuǎn)速過小造成的
  ，用戶可適當(dāng)增加轉(zhuǎn)速
  ，每次增加以 50-100r/min 為基準(zhǔn)，直至達(dá)到最佳分離效果
  。

b：離心后細(xì)胞在分離液中，是由于轉(zhuǎn)速過大造成的，用戶可適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速，每次降低以 50-100r/min 為基準(zhǔn)，直至達(dá)到最佳分離效果。
 
本分離液的密度與氣壓、溫度，以及樣本差異，客戶需要對離心條件進行調(diào)整，建議調(diào)整時，恒定離心時間，調(diào)整轉(zhuǎn)速來達(dá)到最佳分離效果  

• 需要分離的樣本差異
  ，可能對離心效果有影響：a：需要分離的樣本量過大或細(xì)胞密度過高，可能造成離心效果不佳

  。b：需要分離的樣本中細(xì)胞密度過低

  ，離心后可能造成環(huán)狀乳白色細(xì)胞層模糊不清?div id="jfovm50" class="index-wrap">？蛻艨蛇m當(dāng)調(diào)整細(xì)胞密度

  ，直至達(dá)到最佳分離效果。

 

• 本公司分離液符合國家各項標(biāo)準(zhǔn)
  ，如有紅細(xì)胞沉降不完全的情況

  ，有可能是樣本量過大，離心管中樣本的高度過高

  ，在離心過程中樣本通過分離液的時間不同造成的

  。用戶可通過適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速，直至達(dá)到最佳分離效果

  。

 

• 在對轉(zhuǎn)速進行加減的嘗試中
  ，離心力最小不得小于 450g，最大不得大于 1200g
  ，離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)
  。

【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
 

• 所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

 

• 所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
  。

 

• 所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定方法

 
A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù) D.PCR 技術(shù)
 
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
 

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過大	調(diào)整細(xì)胞密度
離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小

 

• 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度
  、大氣壓等密切相關(guān)
  。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進行適當(dāng)調(diào)整
  。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離心時間
  ，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整
  。

 

• 本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料
  ，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同
  ，可

 
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
 
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果