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中文名稱：兔血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名：兔血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒

產(chǎn)品類別：血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離

產(chǎn)品編號(hào)：VE2011R

產(chǎn)品名稱：兔血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：2X200ml/Kit

產(chǎn)品價(jià)格：￥1200.00元

本品用于分離兔血管內(nèi)皮細(xì)胞

“XXXX”動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0043SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】

2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用

，試劑內(nèi)容如下：

	名稱	產(chǎn)品編號(hào)	規(guī)格

A	分離液 1		200ml

B	分離液 2		200ml

C	試劑 F（贈(zèng)品）	F2013TBD	200ml

D	樣本稀釋液（贈(zèng)品）	2010C1119	200ml
E	清洗液（贈(zèng)品）	2010X1118	200ml
F	說(shuō)明書		1 份

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

適用儀器:最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

【檢驗(yàn)方法】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行

。

首先制備單細(xì)胞懸液
，制備方法詳見(jiàn)“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)（文檔編號(hào)：

TBD0004SOP）”。

取一支離心管
，依次小心加入分離液 1
、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1
。如細(xì)胞懸液為 2ml
，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml
。試劑總量最少不低于 4ml
。），制成梯度界面
，各液面分層一定要清晰
。

用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，500g
，離心 25min（注：根據(jù)樣本量確定離心條件
，血液樣本量越多，離心力越大
，離心時(shí)間越長(zhǎng)
，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果）。

離心后
，此時(shí)離心管中由上至下分為六層
。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色內(nèi)皮細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）
。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）
。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層
。第六層為紅細(xì)胞層
。

用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）
，混勻細(xì)胞
。

250g，離心 10min
。

棄上清
。

用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

250g
，離心 10min
。

重復(fù) 7、8
、9
，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

分離圖例：

【差異貼壁法純化細(xì)胞】

（1）用內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：TBD20180011）或內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)

品編號(hào)：TBD20180051）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞

，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞

板或細(xì)胞瓶中

，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）

。

（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮

、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞

。

（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞

。

注：

無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清
。

完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）
。

由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成本相對(duì)較低
。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰

性分選

。

【注意事項(xiàng)】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行
。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差
。樣品放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
，應(yīng)使用無(wú)靜電
、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁
、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面
，影響細(xì)胞分離效果。

吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加
。

如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低
，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

常溫保存

，有效期 2 年

。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作

。無(wú)菌條件下操作

，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存

，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶

，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞提取率大于 80%

。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例

，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

	紅細(xì)胞		白細(xì)胞		血小板

		（4.0-10.0）×10⁹
含量（個(gè)/L）	（4.0-5.5）×10¹²	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×10¹¹
		50%-70%	20%-40%	3%-8%

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

由于血液粘度或其他個(gè)體差異
，可能會(huì)造成以下兩種情況：a：離心后細(xì)胞在上層的血漿層中或稀釋液層中
，是由于轉(zhuǎn)速過(guò)小造成的，用戶可適當(dāng)增加轉(zhuǎn)速
，每次增加以 50-100r/min 為基準(zhǔn)
，直至達(dá)到最佳分離效果。

b：離心后細(xì)胞在分離液中

，是由于轉(zhuǎn)速過(guò)大造成的

，用戶可適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速，每次降低以 50-100r/min 為基準(zhǔn)

，直至達(dá)到最佳分離效果

。

本分離液的密度與氣壓、溫度

，以及樣本差異

，客戶需要對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整

，建議調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間

，調(diào)整轉(zhuǎn)速來(lái)達(dá)到最佳分離效果

。

需要分離的樣本差異，可能對(duì)離心效果有影響：a：需要分離的樣本量過(guò)大或細(xì)胞密度過(guò)高
，可能造成離心效果不佳
。b：需要分離的樣本中細(xì)胞密度過(guò)低，離心后可能造成環(huán)狀乳白色細(xì)胞層模糊不清
?div id="m50uktp" class="box-center"> ？蛻艨蛇m當(dāng)調(diào)整細(xì)胞密度，直至達(dá)到最佳分離效果
。

本公司分離液符合國(guó)家各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)
，如有紅細(xì)胞沉降不完全的情況，有可能是樣本量過(guò)大
，離心管中樣本的高度過(guò)高
，在離心過(guò)程中樣本通過(guò)分離液的時(shí)間不同造成的。用戶可通過(guò)適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速
，直至達(dá)到最佳分離效果
。

在對(duì)轉(zhuǎn)速進(jìn)行加減的嘗試中，離心力最小不得小于 450g
，最大不得大于 1200g
，離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)
。

所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
。

所獲得內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定方法

A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù) D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過(guò)大	調(diào)整細(xì)胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn)	細(xì)胞密度過(guò)小
離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn)	細(xì)胞密度過(guò)小

本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心
，其密度與溫度
、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整
。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)
，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整
。

本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)
，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同
，可

能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況

，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)

，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)

，直至達(dá)到最佳分離效果

，離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g

。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)

。

技術(shù)支持：庫(kù)價(jià)化學(xué)(KuuJia)

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別名	兔血管內(nèi)皮細(xì)胞分離液試劑盒
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