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中文名稱：豚鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名：豚鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒

豚鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液實驗方法產(chǎn)品編號：VE2012GKG 產(chǎn)品名稱：豚鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒本品用于分離豚鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞技術(shù)文檔編號：TBD0045SOP 【產(chǎn)品規(guī)格】 2×200ml/Kit 【產(chǎn)品組成】為方便廣大用戶使用

，試劑內(nèi)容如下：名稱產(chǎn)品編號規(guī)格 A 分離液 1 200ml B 分離液 2 200ml C 樣本稀釋液（贈品） 2010C1119 200ml D 清洗液（贈品） 2010X1118 200ml E 勻漿沖洗液（贈品） F2013TBD 200ml F 洗滌液（贈品） TBDTM-W 200ml G 說明書 1 份【實驗前準(zhǔn)備】 1.適用儀器最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機 2.無菌硅化離心管序號產(chǎn)品名稱產(chǎn)品貨號規(guī)格 1 無菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈 5 支） TUB2015 100 支/包【骨髓單細(xì)胞懸液的制備】 1.以適當(dāng)方式處死動物

，剝離出股骨或脛骨，用剪刀剪斷骨頭兩端

，露出內(nèi)腔

。 2.用注射器吸取適量（根據(jù)動物大小）的勻漿沖洗液（產(chǎn)品編號：F2013TBD）沖洗出內(nèi)腔中的骨髓

。 3.收集懸液到合適離心管中

，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，以 70μm 細(xì)胞篩網(wǎng)（產(chǎn)品編號：TBDTM-SC

，隨試劑盒附贈 5 個）過濾

。 4.450g，離心 10min

，棄上清

。 5.用樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）重懸細(xì)胞濃度為 2×108–1×109/ml 的單細(xì)胞懸液備用（以小鼠為例，一般使用 1ml 樣本稀釋液重懸骨髓細(xì)胞）

。【檢驗方法】全過程樣本

、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。 1.取一支離心管

，依次小心加入分離液 1

、分離液 2（體積比為 3:1

，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1。如細(xì)胞懸液為 2ml

，則先后加入分離液 1：3ml

、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml

。）

，制成梯度界面，各液面分層一定要清晰

。 2.用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上

，500g，離心 20-30min（注：根據(jù)樣本量確定離心條件

，血液樣本量越多

，離心力越大，離心時間越長

，具體離心條件需客戶自行摸索

，以達(dá)到最佳分離效果）。 3.離心后

，此時離心管中由上至下分為六層

。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色內(nèi)皮祖細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）

。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán)）

。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層

。第六層為紅細(xì)胞層

。 4.用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 5-10ml 洗滌液（產(chǎn)品編號：TBDTM-W）

，混勻細(xì)胞

。 5.400g，離心 10min

。 6.棄上清

。 7.用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。 8.250g

，離心 10min

。 9.重復(fù) 7、8

、9

，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。分離圖例：【差異貼壁法純化細(xì)胞】（1）用內(nèi)皮祖細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：TBD20180012）或內(nèi)皮祖細(xì)胞完全培養(yǎng) 基（產(chǎn)品編號：TBD20180052）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細(xì)胞

，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中

，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)

。（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。（3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮

、內(nèi)皮祖細(xì)胞

、干細(xì)胞。（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞

。注： a)無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分

，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。 b)完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）

。 c)由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的

，此法成本相對較低

。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選

。【注意事項】 1.全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行

。為獲得最佳的實驗結(jié)果

，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實驗，樣品存放時間越長

，細(xì)胞分離效果越差

。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。 2.本實驗最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品

，應(yīng)使用無靜電

、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁

、堿處理的玻璃表面會變成毛面

，影響細(xì)胞分離效果。 3.吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加

。 4.分離液用量大于骨髓單細(xì)胞懸液樣本時

，分離效果更佳。 5.如實驗后細(xì)胞得率或活性過低

，請聯(lián)系天津灝洋技術(shù)支持以尋求幫助

，具體聯(lián)系方式詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。【儲存條件及有效期】常溫保存

，有效期 2 年

。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作

。無菌條件下操作

，啟封后置常溫保存。如 4℃保存

，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶

，影響分離效果

。【參考值（參考范圍）】本實驗內(nèi)皮祖細(xì)胞提取率大于 80%。【相關(guān)實驗技術(shù)方案】 1.骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)

。 2.所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)

。 3.所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。 4.所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù) D.PCR 技術(shù) 【可能存在的問題及解決方法】 1. 由于血液粘度

、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：出現(xiàn)情況出現(xiàn)原因建議解決方案離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速離心后目的細(xì)胞存在于分離液中轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長離心后白環(huán)層彌散細(xì)胞密度過大調(diào)整細(xì)胞密度離心后白環(huán)層太淺或看不見細(xì)胞密度過小 2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心

，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)

。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整

。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間

，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整

。 3.本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料

，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同

，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速

。注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時

，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果

，離心力最小不得小于 400g

，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)

。