中文名稱:猴外周血造血干細(xì)胞分離液KIT
中文別名:猴外周血造血干細(xì)胞分離液KIT
產(chǎn)品類別:造血干細(xì)胞的分離
產(chǎn)品編號(hào):LGS1074W
產(chǎn)品名稱:猴外周血造血干細(xì)胞分離液KIT
產(chǎn)品規(guī)格:200ml/KIT
產(chǎn)品價(jià)格:¥500.00元
本品用于分離猴外周血造血干細(xì)胞
“XXXX”動(dòng)物外周血干細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
技術(shù)文檔編號(hào):TBD0029SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用
,試劑內(nèi)容如下:
|
名稱 |
產(chǎn)品編號(hào) |
規(guī)格 |
|
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A |
XXXX 動(dòng)物外周血干細(xì)胞分離液 |
|
200ml |
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B |
樣本稀釋液(贈(zèng)品) |
2010C1119 |
200ml |
|
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|
|
C |
清洗液(贈(zèng)品) |
2010X1118 |
200ml |
|
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|
|
D |
說(shuō)明書(shū) |
|
1 份 |
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【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
適用儀器:最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本
、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例加樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào):2010C1119)混勻
,
根據(jù)稀釋后的樣本量大小
,分以下兩種情況:
情況 A:稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時(shí),實(shí)驗(yàn)方法如下:
- 取一支 15ml 離心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液(注:分離液最少不得少于 3ml)。
- 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上,400-500g ,離心 20-30min(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時(shí)間越長(zhǎng),具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到最佳分離效果)。
- 離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
- 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,往所得離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118),混勻細(xì)胞。
- 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
- 重復(fù) 6、7、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
情況 B:稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時(shí),實(shí)驗(yàn)方法如下:
- 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
- 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上,450-650g(最大離心力可至 1000g),離心 20-30min。(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,血液量越多
,離心力越大
,離心時(shí)間越長(zhǎng),具體離心條件需客戶自行摸索
,以達(dá)到最佳分離效果
。加入血液樣本后,樣本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二)
。
分離圖例:
【差異貼壁法純化細(xì)胞
】
(1)用干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào):CSC2015TBD)或干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(產(chǎn)品
編號(hào):HCSC2015TBD)以 1.5-3×10
6 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板
或細(xì)胞瓶中
,放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)
。
(2)2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。
(3)10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮
、內(nèi)皮祖細(xì)胞
、干細(xì)胞。
(4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞
。
注:
- 無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或
2-8%經(jīng)篩選的胎牛血清。
b) 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)
。
由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的
,此法成本相對(duì)較
低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選
。
【注意事項(xiàng)】
- 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),血液存放時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
- 本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面,影響細(xì)胞分離效果
。
- 吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加
。
- 吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
- 分離液用量大于稀釋后的血液樣本時(shí)
,分離效果更佳
。
- 如實(shí)驗(yàn)后干細(xì)胞得率或活性過(guò)低,請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助
。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存
,有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌
,需無(wú)菌條件操作
。無(wú)菌條件下操作,啟
封后置常溫保存
。如 4℃保存
,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果
。
【參考值(參考范圍)】
本實(shí)驗(yàn)外周血干細(xì)胞提取率大于 80%
。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考
。
|
|
紅細(xì)胞 |
|
白細(xì)胞 |
|
血小板 |
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|
(4.0-10.0)×109 |
|
含量(個(gè)/L) |
(4.0-5.5)×1012 |
中性粒細(xì)胞 |
淋巴細(xì)胞 |
單核細(xì)胞 |
(1.0-3.0)×1011 |
|
|
|
50%-70% |
20%-40% |
3%-8% |
|
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|
|
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】 |
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|
1. |
所獲得干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù) 。 |
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|
|
|
2. |
所獲得干細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。 |
|
|
|
3. |
所獲得干細(xì)胞的鑒定方法 |
|
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|
A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1. 由于血液粘度
、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示:
出現(xiàn)情況 |
出現(xiàn)原因 |
建議解決方案 |
|
|
|
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 |
轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 |
適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
|
|
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 |
轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) |
|
|
|
|
離心后白環(huán)層彌散 |
細(xì)胞密度過(guò)大 |
調(diào)整細(xì)胞密度 |
|
|
離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn) |
細(xì)胞密度過(guò)小 |
|
|
|
|
- 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心
,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)
。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整
。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),恒定離心時(shí)間
,對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整
。
- 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級(jí)原料,性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注:在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)
,直至達(dá)到最佳分離效果
,
離心力最小不得小于 400g,最大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)
。
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