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中文名稱(chēng)：狗外周血造血干細(xì)胞分離液KIT
中文別名：狗外周血造血干細(xì)胞分離液KIT

產(chǎn)品類(lèi)別：造血干細(xì)胞的分離

產(chǎn)品編號(hào)：LGS1072GW

產(chǎn)品名稱(chēng)：狗外周血造血干細(xì)胞分離液KIT

產(chǎn)品規(guī)格：200ml/KIT

產(chǎn)品價(jià)格：￥500.00元

本品用于分離狗外周血造血干細(xì)胞

“XXXX”動(dòng)物外周血干細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0029SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】

200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

	名稱(chēng)	產(chǎn)品編號(hào)	規(guī)格

A	XXXX 動(dòng)物外周血干細(xì)胞分離液		200ml

B	樣本稀釋液（贈(zèng)品）	2010C1119	200ml

C	清洗液（贈(zèng)品）	2010X1118	200ml

D	說(shuō)明書(shū)		1 份

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

適用儀器:最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

【檢驗(yàn)方法】

全過(guò)程樣本

、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行

。

首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例加樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）混勻，

根據(jù)稀釋后的樣本量大小

，分以下兩種情況：

情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時(shí)
，實(shí)驗(yàn)方法如下：

取一支 15ml 離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）
。

用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上
，400-500g ，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液樣本量越多
，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)
，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果）。

離心后
，此時(shí)離心管中由上至下分為四層
。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層
。第三層為透明分離液層
。第四層為紅細(xì)胞層。

用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）
，混勻細(xì)胞
。

250g，離心 10min
。

棄上清
。

用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

250g
，離心 10min
。

重復(fù) 6、7
、8
，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時(shí)
，實(shí)驗(yàn)方法如下：

取一支適當(dāng)?shù)碾x心管
，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。

將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上
，450-650g（最大離心力可至 1000g）
，離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液量越多
，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)
，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果。加入血液樣本后
，樣本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二）
。

剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9。

分離圖例：

【差異貼壁法純化細(xì)胞】

（1）用干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：CSC2015TBD）或干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)品

編號(hào)：HCSC2015TBD）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞

，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板

或細(xì)胞瓶中

，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱(chēng)為單核細(xì)胞）

。

（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮

、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞

。

（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞

。

注：

無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或

2-8%經(jīng)篩選的胎牛血清

。

b) 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成本相對(duì)較

低

。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選

。

【注意事項(xiàng)】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行
。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)
，細(xì)胞分離效果越差
。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
，應(yīng)使用無(wú)靜電
、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁
、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面
，影響細(xì)胞分離效果。

吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加
。

吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜
。

分離液用量大于稀釋后的血液樣本時(shí)，分離效果更佳
。

如實(shí)驗(yàn)后干細(xì)胞得率或活性過(guò)低
，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

常溫保存

，有效期 2 年

。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作

。無(wú)菌條件下操作

，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存

，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶

，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)外周血干細(xì)胞提取率大于 80%

。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例

，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

		紅細(xì)胞		白細(xì)胞		血小板

			（4.0-10.0）×10⁹
含量（個(gè)/L）		（4.0-5.5）×10¹²	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×10¹¹
			50%-70%	20%-40%	3%-8%

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.	所獲得干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù) 。
2.	所獲得干細(xì)胞的核酸提取技術(shù) 。
3.	所獲得干細(xì)胞的鑒定方法

A.流式細(xì)胞技術(shù)

B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過(guò)大	調(diào)整細(xì)胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn)	細(xì)胞密度過(guò)小
離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn)	細(xì)胞密度過(guò)小

本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心
，其密度與溫度
、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)
，恒定離心時(shí)間
，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)
，全部使用藥用級(jí)原料
，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況
，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速
。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)

，直至達(dá)到最佳分離效果

，

離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g

。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)

。

技術(shù)支持：庫(kù)價(jià)化學(xué)(KuuJia)

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別名	狗外周血造血干細(xì)胞分離液KIT
英文名