中文名稱:鴨外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名:鴨外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒
產(chǎn)品類別:外周血NK細(xì)胞的分離
產(chǎn)品編號(hào):NK2011Y
產(chǎn)品名稱:鴨外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格:2X200ml/Kit
產(chǎn)品價(jià)格:¥1000.00元
本品用于分離鴨外周血NK細(xì)胞
“XXXX”動(dòng)物外周血 NK 細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
技術(shù)文檔編號(hào):TBD0038SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
2×200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用
,試劑內(nèi)容如下:
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名稱 |
產(chǎn)品編號(hào) |
規(guī)格 |
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A |
分離液 1 |
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200ml |
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B |
分離液 2 |
|
200ml |
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C |
清洗液(贈(zèng)品) |
2010X1118 |
200ml |
D |
說明書 |
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1 份 |
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【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
適用儀器:最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
【檢驗(yàn)方法】
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行
。
方法一(需留取血漿備用)
- 首先取抗凝血 250g 離心 10min
,棄血漿,補(bǔ)加胎牛血清(添加量與棄去血漿量等同)制成細(xì)胞懸液
,根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積,選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)
。
- 取一支離心管
,依次小心加入分離液 1
、分離液 2(體積比為 3:1
,試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2:1。如細(xì)胞懸液為 2ml
,則先后加入分離液 1:3ml
、分離液 2:1ml。試劑總量最少不低于 4ml
。)
,制成梯度界面,各液面分層一定要清晰
。
- 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上,400-500g,離心 20-30min(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時(shí)間越長(zhǎng),具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到最佳分離效果)。
- 離心后
,此時(shí)離心管中由上至下分為六層
。第一層為稀釋液層
。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2)
。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層(下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層
。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層
。
- 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中
,向所得離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品
編號(hào):2010X1118)
,混勻細(xì)胞
。
- 250g,離心 10min
。
- 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞
。
- 250g
,離心 10min。
- 重復(fù) 6
、7
、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞
。
分離圖例:
方法二(不需血漿留存?zhèn)溆茫?br />
- 根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管,依次小心加入分離液 1
、分離液 2(體積比為 3:1
,試劑總量與抗凝血體積比為 2:1
。如抗凝血為 2ml
,則先后加入分離液 1:3ml、分離液 2:1ml
。試劑總量最低不低于 4ml。)
,制成梯度界面
,各液面分層一定要清晰
。
- 用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上,400-500g
,離心 20-30min(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件
,血液樣本量越多
,離心力越大
,離心時(shí)間越長(zhǎng),具體離心條件需客戶自行摸索
,以達(dá)到最佳分離效果)。
- 離心后
,此時(shí)離心管中由上至下分為六層
。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2)
。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層
。第五層為粒細(xì)胞層
。第六層為紅細(xì)胞層
。
- 后續(xù)步驟同方法一
。
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
(1)用 NK 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào):CNK2015)或 NK 細(xì)胞完全培養(yǎng)基(產(chǎn)品
編號(hào):HCNK2015)以 1.5-3×10
6 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞
,將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)
胞瓶中
,放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)
。
(2)2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。
(3)10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮
、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞
。
(4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞
。
注:
- 無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清
。
- 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。
- 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的
,此法成本相對(duì)較低
。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選
。
【注意事項(xiàng)】
- 全過程樣本
、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
,最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),血液存放時(shí)間越長(zhǎng)
,細(xì)胞分離效果越差
。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的
。
- 本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品
,應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品
,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁
、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。
- 吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
- 吸取過多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜
。
- 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低
,請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存
,有效期 2 年
。本品易感染細(xì)菌,需無(wú)菌條件操作
。無(wú)菌條件下操作
,啟封后置常溫保存。如 4℃保存
,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果
。
【參考值(參考范圍)】
本實(shí)驗(yàn) NK 細(xì)胞提取率大于 80%
。
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下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。 |
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紅細(xì)胞 |
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白細(xì)胞 |
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血小板 |
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(4.0-10.0)×109 |
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含量(個(gè)/L) |
(4.0-5.5)×1012 |
中性粒細(xì)胞 |
淋巴細(xì)胞 |
|
單核細(xì)胞 |
(1.0-3.0)×1011 |
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50%-70% |
20%-40% |
|
3%-8% |
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【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】 |
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- 所獲得 NK 細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
- 所獲得 NK 細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
- 所獲得 NK 細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度
、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:
出現(xiàn)情況 |
出現(xiàn)原因 |
建議解決方案 |
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離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 |
轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短 |
適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
|
|
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 |
轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng) |
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離心后白環(huán)層彌散 |
細(xì)胞密度過大 |
調(diào)整細(xì)胞密度 |
|
|
離心后白環(huán)層太淺或看不見 |
細(xì)胞密度過小 |
|
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- 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度
、大氣壓等密切相關(guān)
。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整
。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)
,恒定離心時(shí)間
,對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整
。
- 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級(jí)原料
,性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同
,可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況
,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速
。
注:在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)
,直至達(dá)到最佳分離效果
,離心力最小不得小于 400g
,最大不得大于 1200g
。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)
。
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