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中文名稱：小鼠外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名：小鼠外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒

產(chǎn)品類別：外周血NK細(xì)胞的分離

產(chǎn)品編號：NK2011M

產(chǎn)品名稱：小鼠外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：2X200ml/Kit

產(chǎn)品價格：￥800.00元

本品用于分離小鼠外周血NK細(xì)胞

“XXXX”動物外周血 NK 細(xì)胞分離液實驗方法

技術(shù)文檔編號：TBD0038SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】

2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用

，試劑內(nèi)容如下：

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格

A	分離液 1		200ml

B	分離液 2		200ml

C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	說明書		1 份

【實驗前準(zhǔn)備】

適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機

【檢驗方法】

全過程樣本

、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

方法一（需留取血漿備用）

首先取抗凝血 250g 離心 10min
，棄血漿，補加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細(xì)胞懸液
，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗
。

取一支離心管
，依次小心加入分離液 1
、分離液 2（體積比為 3:1
，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1
。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml
、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml
。）
，制成梯度界面，各液面分層一定要清晰
。

用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上
，400-500g
，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液樣本量越多，離心力越大
，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果）。

離心后
，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層
。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán)）
。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層
。第六層為紅細(xì)胞層。

用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中
，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品

編號：2010X1118）

，混勻細(xì)胞

。

250g，離心 10min
。

棄上清。

用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞
。

250g，離心 10min
。

重復(fù) 6、7
、8
，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞
。

分離圖例：

方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?br />

根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管，依次小心加入分離液 1
、分離液 2（體積比為 3:1
，試劑總量與抗凝血體積比為 2：1
。如抗凝血為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml
、分離液 2：1ml。試劑總量最低不低于 4ml
。）
，制成梯度界面
，各液面分層一定要清晰。
用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上
，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液樣本量越多
，離心力越大
，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果）。

離心后
，此時離心管中由上至下分為六層
。第一層為血漿層
。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）
。第四層為透明分離液 1 液層
。第五層為粒細(xì)胞層
。第六層為紅細(xì)胞層
。

后續(xù)步驟同方法一。

【差異貼壁法純化細(xì)胞】

（1）用 NK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：CNK2015）或 NK 細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)品

編號：HCNK2015）以 1.5-3×10⁶ 個/ml 的密度重懸細(xì)胞

，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)

胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)

。

（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）

。

（3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮

、內(nèi)皮祖細(xì)胞

、干細(xì)胞。

（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

注：

無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分
，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）
。

由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的
，此法成本相對較低
。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選
。

【注意事項】

全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行
。為獲得最佳的實驗結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實驗
，血液存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差
。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

本實驗最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
，應(yīng)使用無靜電
、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品
，因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果
。

吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

吸取過多的目的細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜
。

如所實驗后細(xì)胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助
。

【儲存條件及有效期】

常溫保存，有效期 2 年

。本品易感染細(xì)菌

，需無菌條件操作。無菌條件下操作

，啟封后置常溫保存。如 4℃保存

，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶

，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】

本實驗 NK 細(xì)胞提取率大于 80%

。


下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

	紅細(xì)胞		白細(xì)胞		血小板

		（4.0-10.0）×10⁹
含量（個/L）	（4.0-5.5）×10¹²	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×10¹¹
		50%-70%	20%-40%	3%-8%

【相關(guān)實驗技術(shù)方案】

所獲得 NK 細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

所獲得 NK 細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
。

所獲得 NK 細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1. 由于血液粘度

、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長

離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過大	調(diào)整細(xì)胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小
離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小

本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心
，其密度與溫度
、大氣壓等密切相關(guān)
。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時
，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整
。