。
 
方法一（需留取血漿備用）
 

• 首先取抗凝血 250g 離心 10min
  ，棄血漿，補(bǔ)加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細(xì)胞懸液

  ，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積

  ，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)。

 

• 取一支離心管
  ，依次小心加入分離液 1

  、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1

  。如細(xì)胞懸液為 2ml

  ，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml

  。試劑總量最少不低于 4ml

  。），制成梯度界面

  ，各液面分層一定要清晰。

 

• 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上
  ，400-500g
  ，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多
  ，離心力越大
  ，離心時(shí)間越長，具體離心條件需客戶自行摸索
  ，以達(dá)到最佳分離效果）
  。

 

• 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層
  。第一層為稀釋液層
  。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）
  。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層
  。第五層為粒細(xì)胞層
  。第六層為紅細(xì)胞層。

 

• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中
  ，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品

 
 
編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 

• 250g
  ，離心 10min
  。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞
  。

 

• 250g
  ，離心 10min。

 

• 重復(fù) 6
  、7

  、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞

  。

 
分離圖例：
 
 
 
 
方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?br />  

• 根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管
  ，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1

  ，試劑總量與抗凝血體積比為 2：1

  。如抗凝血為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml

  、分離液 2：1ml

  。試劑總量最低不低于 4ml。）

  ，制成梯度界面

  ，各液面分層一定要清晰。
• 用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上
  ，400-500g
  ，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多
  ，離心力越大
  ，離心時(shí)間越長，具體離心條件需客戶自行摸索
  ，以達(dá)到最佳分離效果）
  。

 

• 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層
  。第一層為血漿層
  。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）
  。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層
  。第五層為粒細(xì)胞層
  。第六層為紅細(xì)胞層。

 

• 后續(xù)步驟同方法一
  。

 
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
 
 
（1）用 NK 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：CNK2015）或 NK 細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)品
 
編號：HCNK2015）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)
 
胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
 
（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
 
（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
 
注：
 

• 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分
  ，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清
  。

 

• 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

 

• 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的
  ，此法成本相對較低

  。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。

 
【注意事項(xiàng)】
 

• 全過程樣本
  、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行

  。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

  ，血液存放時(shí)間越長

  ，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的

  。

 

• 本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
  ，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品

  ，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁

  、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果

  。

 

• 吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

 

• 吸取過多的目的細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜
  。

 

• 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低
  ，請聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗(yàn) NK 細(xì)胞提取率大于 80%。
 
 

	下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例 ，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考 。
		紅細(xì)胞		白細(xì)胞			血小板
			（4.0-10.0）×109
	含量（個(gè)/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞		單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×1011
			50%-70%	20%-40%		3%-8%
	【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

 

• 所獲得 NK 細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

 

• 所獲得 NK 細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
  。

 

• 所獲得 NK 細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)

 
D.PCR 技術(shù)
 
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
1. 由于血液粘度