。
 
方法一（需留取血漿備用）
 

• 首先取抗凝血 250g 離心 10min，棄血漿
  ，補(bǔ)加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細(xì)胞懸液

  ，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)

  。

 

• 取一支離心管
  ，依次小心加入分離液 1

  、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1

  。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml

  、分離液 2：1ml

  。試劑總量最少不低于 4ml。）

  ，制成梯度界面，各液面分層一定要清晰

  。

 

• 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上
  ，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
  ，血液樣本量越多
  ，離心力越大
  ，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索
  ，以達(dá)到最佳分離效果）。

 

• 離心后
  ，此時(shí)離心管中由上至下分為六層
  。第一層為稀釋液層
  。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）
  。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層
  。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層
  。

 

• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品

編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 

• 250g
  ，離心 10min

  。

 

• 棄上清
  。

 

• 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞
  。

 

• 250g，離心 10min
  。

 

• 重復(fù) 6、7
  、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞
  。分離圖例

 
 
 
方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?br />  

• 根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管
  ，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1
  ，試劑總量與抗凝血體積比為 2：1
  。如抗凝血為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml
  、分離液 2：1ml。試劑總量最低不低于 4ml
  。），制成梯度界面
  ，各液面分層一定要清晰
  。
• 用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上，400-500g
  ，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
  ，血液樣本量越多，離心力越大
  ，離心時(shí)間越長(zhǎng)
  ，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索
  ，以達(dá)到最佳分離效果）

  。

 

• 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層
  。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）

  。第四層為透明分離液 1 液層

  。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層

  。

 

• 后續(xù)步驟同方法一。

 
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
 
（1）用單核細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：CTBD2011）或單核細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)品
 
編號(hào)：HCTBD2011）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或
 
細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
 
（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱(chēng)為單核細(xì)胞）。
 
（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
 
注：
 

• 無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分
  ，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

 

• 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）
  。

 

• 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選
  。

 
【注意事項(xiàng)】
 

• 全過(guò)程樣本
  、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  ，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)

  ，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的

  。

 

• 本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電
  、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁

  、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面

  ，影響細(xì)胞分離效果

  。

 

• 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低
  ，請(qǐng)聯(lián)系上海研謹(jǐn)技術(shù)以尋求支持幫助。

 
【儲(chǔ)存條件及有效期】
 
常溫保存