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中文名稱：虎外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名：虎外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒

產(chǎn)品類別：外周血單核細(xì)胞的分離

產(chǎn)品編號(hào)：TBD2011T

產(chǎn)品名稱：虎外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：2X200ml/Kit

產(chǎn)品價(jià)格：￥1000.00元

本品用于分離虎外周血單核細(xì)胞

“XXXX”動(dòng)物外周血單核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0025SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】

2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

	名稱	產(chǎn)品編號(hào)	規(guī)格

A	分離液 1		200ml

B	分離液 2		200ml

D	清洗液（贈(zèng)品）	2010X1118	200ml
E	說明書		1 份

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

【檢驗(yàn)方法】

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行

。

方法一（需留取血漿備用）

首先取抗凝血 250g 離心 10min
，棄血漿，補(bǔ)加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細(xì)胞懸液
，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積
，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)
。

取一支離心管，依次小心加入分離液 1
、分離液 2（體積比為 3:1
，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1。如細(xì)胞懸液為 2ml
，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml
。試劑總量最少不低于 4ml。）
，制成梯度界面
，各液面分層一定要清晰
。

用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-500g
，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液樣本量越多
，離心力越大
，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果）。

離心后
，此時(shí)離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層
。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）
。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）
。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層
。第六層為紅細(xì)胞層
。

用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中
，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品

編號(hào)：2010X1118）

，混勻細(xì)胞

。

250g
，離心 10min
。

棄上清。

用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞
。

250g，離心 10min
。

重復(fù) 6
、7、8
，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞
。分離圖例

方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?br />

根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管
，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1
，試劑總量與抗凝血體積比為 2：1
。如抗凝血為 2ml
，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml
。試劑總量最低不低于 4ml
。），制成梯度界面
，各液面分層一定要清晰。
用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上
，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液樣本量越多，離心力越大
，離心時(shí)間越長(zhǎng)
，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果）
。

離心后
，此時(shí)離心管中由上至下分為六層
。第一層為血漿層
。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）
。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層
。第六層為紅細(xì)胞層
。

后續(xù)步驟同方法一。

【差異貼壁法純化細(xì)胞】

（1）用單核細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：CTBD2011）或單核細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)品

編號(hào)：HCTBD2011）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞

，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或

細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)

。

（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）

。

（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮

、內(nèi)皮祖細(xì)胞

、干細(xì)胞

。

（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞

。

注：

無血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清
。

完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）
。

由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的
，此法成本相對(duì)較低
。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選
。

【注意事項(xiàng)】

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行
。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差
。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
，應(yīng)使用無靜電
、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品
，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁
、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面
，影響細(xì)胞分離效果
。

如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低
，請(qǐng)聯(lián)系上海研謹(jǐn)技術(shù)以尋求支持幫助。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

常溫保存

，有效期 2 年

。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作

。無菌條件下操作，啟

封后置常溫保存

。如 4℃保存

，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶

，影響分離效果

。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)單核細(xì)胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例

，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考

。

	紅細(xì)胞	白細(xì)胞	血小板

含量（個(gè)/L）	（4.0-5.5）×10¹²	（4.0-10.0）×10⁹	（1.0-3.0）×10¹¹

中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞

50%-70% 20%-40% 3%-8%

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

所獲得單核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

所獲得單核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
。

所獲得單核細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1. 由于血液粘度

、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)

離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過大	調(diào)整細(xì)胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小
離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小

本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度
、大氣壓等密切相關(guān)
。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整
。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)
，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整
。

本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同
，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況
，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速
。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)

，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果，

離心力最小不得小于 400g

，最大不得大于 1200g

。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)

。

技術(shù)支持：庫價(jià)化學(xué)(KuuJia)

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別名	虎外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒
英文名