。
 

• 首先制備脾臟組織單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“脾臟組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”
  。

 

• 取一支 15ml 離心管，加入與脾臟組織單細(xì)胞懸液等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）
  。
• 用吸管小心吸取脾臟組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上
  ，400-500g

  ，離心 20-30min。（注：根據(jù)脾臟組織單細(xì)胞懸液量確定離心條件

  ，脾臟組織單細(xì)胞懸液量越大

  ，離心力越大

  ，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索

  ，以達(dá)到最佳分離效果）。

 

• 離心后
  ，此時(shí)離心管中由上至下分為四層

  。第一層為稀釋液層

  。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層

  。第四層為紅細(xì)胞層

  。

 

• 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）
  ，混勻細(xì)胞。
• 250g
  ，離心 10min
  。

 

• 棄上清
  。

 

• 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

 

• 250g
  ，離心 10min。

 

• 重復(fù) 7
  、8
  、9
  ，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

 
分離圖例
 
 
 
 
【注意事項(xiàng)】
 

• 全過程樣本
  、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行
  。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)
  ，細(xì)胞分離效果越差

  。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

 

• 本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
  ，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品

  ，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面

  ，影響細(xì)胞分離效果。

 

• 吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加
  。

 

• 分離液用量大于制備的脾臟組織單細(xì)胞懸液樣本時(shí)
  ，分離效果更佳
  。

 

• 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)聯(lián)系上海研謹(jǐn)技術(shù)以尋求支持幫助
  。

 
【儲(chǔ)存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗(yàn)單個(gè)核細(xì)胞提取率及純度大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
 

	紅細(xì)胞		白細(xì)胞			血小板
		（4.0-10.0）×109
含量（個(gè)/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞		單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×1011
		50%-70%	20%-40%		3%-8%

 
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
 

• 脾臟組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)
  。

 

• 所獲得單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)
  。

 

• 所獲得單個(gè)核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
  。

 

• 所獲得單個(gè)核細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)

 
D.PCR 技術(shù)
 
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
 

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)
離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過大	調(diào)整細(xì)胞密度
離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小

 

• 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度
  、大氣壓等密切相關(guān)
  。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)

  ，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整

  。

 

• 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)
  ，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同

  ，可

 
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速