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中文名稱：馬外周血淋巴細(xì)胞分離液KIT
中文別名：馬外周血淋巴細(xì)胞分離液KIT

馬外周血淋巴細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

本品用于分離馬外周血淋巴細(xì)胞

技術(shù)文檔編號：TBD0017SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】

200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格

A	馬外周血淋巴細(xì)胞分離液		200ml

B	樣本稀釋液（贈品）	2010C1119	200ml

C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	說明書		1 份

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

【檢驗(yàn)方法】

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行

。

首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）混勻，根據(jù)

稀釋后的樣本量大小

，分以下兩種情況：

情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時

，實(shí)驗(yàn)方法如下：

取一支 15ml 離心管
，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）
。

用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上
，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液樣本量越多，離心力越大
，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果）。

離心后
，此時離心管中由上至下分為四層
。第一層為血漿層
。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層
。第三層為透明分離液層
。第四層為紅細(xì)胞層。

用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中
，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）
，混勻細(xì)胞
。
250g，離心 10min
。

棄上清
。

用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞
。

250g，離心 10min
。

重復(fù) 6
、7
、8
，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞
。

情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時
，實(shí)驗(yàn)方法如下：

取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液
。

將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，550-650g（最大離心力可至 1000g）
，離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件
，血液量越多，離心力越大
，離心時間越長
，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達(dá)到最佳分離效果
。加入血液樣本后
，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）
。

剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9
。

分離圖例

【注意事項(xiàng)】

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行
。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
，血液存放時間越長
，細(xì)胞分離效果越差
。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的
。

本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品
，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品
，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁
、堿處理的玻璃表面會變成毛面
，影響細(xì)胞分離效果
。

吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加
。

吸取過多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低
，請聯(lián)系上海研謹(jǐn)生物技術(shù)人員以尋求幫助
。

【儲存條件及有效期】

常溫保存

，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌

，需無菌條件操作

。無菌條件下操作

，啟

封后置常溫保存

。如 4℃保存

，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶

，影響分離效果

。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%

。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例

，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考

。

	紅細(xì)胞		白細(xì)胞		血小板

		（4.0-10.0）×10⁹
含量（個/L）	（4.0-5.5）×10¹²	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×10¹¹
		50%-70%	20%-40%	3%-8%

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)
。

所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
。

所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】
1.	由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

	出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層		轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

	離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
	離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長

	離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過大	調(diào)整細(xì)胞密度

	離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小
	離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小

2.	本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān) 。不同地