中文名稱：大鼠外周血淋巴細胞分離液KIT
中文別名：大鼠外周血淋巴細胞分離液KIT
大鼠外周血淋巴細胞分離液實驗方法
本品用于分離大鼠外周血淋巴細胞
技術(shù)文檔編號：TBD0017SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用
，試劑內(nèi)容如下：
| |
名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
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| A |
XXXX 動物外周血淋巴細胞分離液 |
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200ml |
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| B |
樣本稀釋液（贈品） |
2010C1119 |
200ml |
| |
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|
| C |
清洗液（贈品） |
2010X1118 |
200ml |
| D |
說明書 |
|
1 份 |
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【實驗前準備】
適用儀器：最大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機
【檢驗方法】
全過程樣本
、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）混勻
，根據(jù)
稀釋后的樣本量大小
，分以下兩種情況：
情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時，實驗方法如下：
- 取一支 15ml 離心管
，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）
。
- 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g
，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多
，離心力越大
，離心時間越長
，具體離心條件需客戶自行摸索
，以達到最佳分離效果）
。
- 離心后
，此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層
。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層
。第四層為紅細胞層。
- 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中
，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）
，混勻細胞。
- 250g，離心 10min。
- 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
- 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時，實驗方法如下：
- 取一支適當?shù)碾x心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
- 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，550-650g（最大離心力可至 1000g），離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果
。加入血液樣本后
，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）
。
分離圖例
【注意事項】
- 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
- 本實驗最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。
- 吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。
- 吸取過多的淋巴細胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
- 如所實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系上海研謹生物技術(shù)人員以尋求幫助。
【儲存條件及有效期】
常溫保存
，有效期 2 年
。本品易感染細菌
，需無菌條件操作
。無菌條件下操作，啟
封后置常溫保存
。如 4℃保存
，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶
，影響分離效果
。
【參考值（參考范圍）】
本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例
，用戶可適當進行參考。
| |
紅細胞 |
|
白細胞 |
|
血小板 |
| |
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（4.0-10.0）×109 |
|
| 含量（個/L） |
（4.0-5.5）×1012 |
中性粒細胞 |
淋巴細胞 |
單核細胞 |
（1.0-3.0）×1011 |
| |
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50%-70% |
20%-40% |
3%-8% |
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| 【相關(guān)實驗技術(shù)方案】 |
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|
- 所獲得淋巴細胞的培養(yǎng)技術(shù)
。
- 所獲得淋巴細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
| 【可能存在的問題及解決方法】 |
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|
| 1. |
由于血液粘度 、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示： |
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出現(xiàn)情況 |
出現(xiàn)原因 |
|
建議解決方案 |
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|
| 離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 |
轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 |
適當增減轉(zhuǎn)速 |
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| |
離心后目的細胞存在于分離液中 |
轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 |
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離心后白環(huán)層彌散 |
細胞密度過大 |
|
調(diào)整細胞密度 |
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離心后白環(huán)層太淺或看不見 |
細胞密度過小 |
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|
| 2. |
本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度 、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 |
區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時
，恒定離
心時間
，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整
。
- 本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)
，直至達到最佳分離效果，
離心力最小不得小于 400g
，最大不得大于 1200g
。離心時間以 20-30min 為準
。
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