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大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP) 酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定大鼠血清,血漿及相關(guān)液體樣本中腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP) 的含量

。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP) 水平

。用純化的大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP) 抗體包被微孔板，制成固相抗體

，往包被單抗的微孔中依次加入腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP)

，再與HRP標(biāo)記的腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP) 抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物

，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色

。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色

。顏色的深淺和樣品中的腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP) 呈正相關(guān)

。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP) 濃度

。

試劑盒組成：

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說明書	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1個	1個
酶標(biāo)包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品：1350 ng/L	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	1.5ml×1瓶	1.5ml×1瓶	2-8℃保存
酶標(biāo)試劑	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
樣品稀釋液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×20倍）×1瓶	（20ml×30倍）×1瓶	2-8℃保存

樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘

，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清

，保存過程中如出現(xiàn)沉淀

，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑

，混合10-20分鐘后

，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清

，保存過程中如有沉淀形成

，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集

，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）

。仔細(xì)收集上清

，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心

。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行

。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時

，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）

。仔細(xì)收集上清

。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液

，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右

。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份

。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）

。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成

，應(yīng)再次離心

。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量

。加入一定量的PBS

，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?div id="m50uktp" class="box-center"> 。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度

。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分

。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）

。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測

，其余冷凍備用

。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行

，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存

，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品

，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔

，在第一

、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl

，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl

，混勻

；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔

，再在第三

、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻

；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉

，再各取50μl分別加到第五、第六孔中

，再在第五

、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻

；混勻后從第五

、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中

，再在第七

、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七

、第八孔中分別取50μl加到第九

、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl

，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉

。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為900 ng/L

，600 ng/L

，300ng/L，150ng/L

， 75 ng/L）

。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）

、待測樣品孔

。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）

。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部

，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻

。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘

。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用

。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體

，甩干

，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去

，如此重復(fù)5次

，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl

，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3

。
8. 洗滌：操作同5

。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl

，輕輕震蕩混勻

，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）

。
11. 測定：以空白孔調(diào)零

，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行

。

注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用

，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存

。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出

，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果

。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器

，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差

。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)

，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣

。
4．請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線

，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值）

，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定

，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用

，以避免交叉污染

。
6．底物請避光保存

。
7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品

，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理

。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異

，以英文說明書為準(zhǔn)

。

計算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)

，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線

，根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù)

；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式

，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度

，再乘以稀釋
倍數(shù)

，即為樣品的實(shí)際濃度。



（此圖僅供參考）

試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上

。
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和11%

檢測范圍：
35ng/L-1200ng/L

保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：

；2-8℃。
2．有效期：6個月

技術(shù)支持：庫價化學(xué)(KuuJia)

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