上海研謹生物專業(yè)銷售（pBM18A Toposmart Cloning Kit 克隆試劑盒）歡迎您咨詢訂購

！
產品信息：

組分	JCL073-01 (20次)	JCL073-02 (20次×3)
pBM18A Vector (20ng/ml )	20ml	20ml×3
10×Toposmart	20ml	20ml×3
Control Insert LacZα	5ml	5ml
M13F(-47) Primer	0.1OD	0.1OD×3
M13R(-48) Primer	0.1OD	0.1OD×3

產品介紹：
pBM18ATopotsmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中，不僅適用于克隆由Pfu

、KOD、Xerox

、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產物，也可克隆由Taq

、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產物

。陽性克隆可用M13F(-47)和M13R(-48) 引物進行菌落PCR鑒定

。SmaI和XhoI單酶切可將克隆片段酶切出來

。載體的多克隆位點兩側具有SP6和T7 RNA聚合酶啟動子序列，可用于體外RNA轉錄

。載體不含LacZ基因

，不能進行藍白斑篩選。

產品特點：

1. 使用各種DNA聚合酶擴增的PCR產物

。
2. PCR 引物 5’端不能進行磷酸修飾

，普通商業(yè)化引物即可。
3. 載體采用了新的制備工藝

，無需藍白斑篩選

。
4. 載體具有氨芐青霉素抗性。操作步驟

1. 連接反應

按下表

，在一個 0.2ml PCR 管中依次加入

成分	體積
DNA 片段	0.5-8ml
pBM18A Vector	1ml
10×Toposmart	1ml
補水至總體積	10ml

加完試劑后

，輕輕混勻低速離心

，使溶液集中在管底。注意：此步驟不要在低溫條件下（冰水?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">。┥喜僮鳌?

2. 反應溫度及片段要求

室溫下（20-30℃）放置 5-30 分鐘

，然后將離心管放置在冰上。如當天不進行轉化實驗

。請將連接產物置于-20℃保存。
注意：DNA 片段的用量見下表

片段大?div id="4qifd00" class="flower right">。╞p）	最佳用量（ng）
100-1000	20-50
1000-2000	50-100
2000-5000	100-200

室溫下（20-30℃）反應時間 5-30 分鐘

，如果室溫較低

，推薦使用 PCR 儀控溫?div id="4qifd00" class="flower right">

？梢栽O置 25℃反應 5-30 分鐘。如果 PCR 產物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶

，無引物二聚體和非特異性條帶存在

，可直接取 0.5-1ml 的 PCR 產物原液進行克隆

。

3. 陽性對照反應

取 1ml 試劑盒提供的 1kb 長度的對照片段 LacZ 基因 α肽片段進行克隆，轉化具有α互補功能的大腸桿菌感受態(tài)細胞（如 DH5α,TOP10,Mach1T1 等）

。菌液涂布在含有 IPTG 和 X-gal 的 LB 氨芐平板上

，次日藍色菌落為陽性克隆，說明有片段插入

，白色菌落為空載體

。

4. 轉化

（1）取 5ml 連接產物到 50-100ml 剛剛融化的感受態(tài)細胞中

，輕輕混勻，冰浴
20-30 分鐘

。
（2）42℃水浴中熱擊 30 秒。
（3）立刻置于冰水浴中 2 分鐘

。
（4）加入 300-500μl 無菌的不含抗生素的SOC 或 LB

，37℃

，200-250rpm 振蕩培養(yǎng) 60 分鐘。
注：小于 2kb 片段可以不復蘇

，直接涂平板

。
（5）吸取 200ml 菌液涂布

。為了得到更多的菌落

，可以先 4000rpm 離心 1 分鐘

，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體

，充分懸浮菌液

，取全部菌液涂布，然后37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時）

。
5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR
（1）菌落PCR方法鑒定陽性克隆

① 用10ml吸頭挑選克隆至預先加有10ml無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中

，吹打混合

。
② 25ml PCR反應體系：取2ml細菌懸液為模板、加入5mM 濃度的M13F(-47)

、
M13R(-48)各1ml進行PCR擴增。
③PCR擴增條件：95℃預變性5分鐘（裂解細胞

，失活核酸酶）

，94℃變性10秒鐘，55℃退火10秒鐘

，72℃延伸（根據(jù)片段的大小決定延伸時間

，通常每1min/1kb）X秒

，30個循環(huán)

，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果

，有強烈的明顯條帶的克隆為重組體

，與插入片段大小相近【M13F(-47)

、M13R(-48)引物在克隆位置的兩側，所以PCR 擴增出的DNA的長度比插入片段大229bp】可視為陽性克隆

。菌落PCR 方法鑒定重組子時一定要設立一個不加菌液的陰性對照

。
（2）測序：用M13F(-47)

、M13R(-48)通用引物對陽性質粒進行測序分析

。

6.

pBM18A載體圖譜7. 常見問題分析
(1) 重組子克隆菌少

，或陽性率低：感受態(tài)效率低，使用轉化效率>5×107cfu/μg 的感受態(tài)細胞
(2) 連接反應在低溫下（如放碎冰上）操作

，應該在室溫下操作

。
(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入

。
(4) PCR 純度低

，重新擴增或重新純化 PCR 產物

。
(5) PCR 質量低，切膠時在紫外下照射時間長

，需重新制備。
(6) PCR 擴增結束后

，應該再延伸 5-10 分鐘

，確保片段延伸完全

。
(7) 轉化后沒有復蘇培養(yǎng)，可以加入SOC 或 LB，培養(yǎng) 60 分鐘

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？寺』蚩?/div>
能對宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和DNA 結合蛋白的基因

，某些啟動子和調節(jié)序列基因

，或含有倒置或串聯(lián)重復序列的基因

，選用室溫過夜培養(yǎng)平板

，或換用低拷貝質粒載體。

載體序列：

>pBM18A 1952bp AAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA AAACGACGGCCAGCCAATTGAAGCTATTTAGGTGACACTATAGATATCGAGCTCGAGGATCCATGGTA

CCCGGGCGTGTCG CGACACGCCCGGGTCTAGACTGCAGCTCGAGGCATGCAAGCT
TTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCCATCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCGT CCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAAC TTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAA GGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTG GGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCC AATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCAT CTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGC CAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC ATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACC ACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTC CGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCA CTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA TGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAAT GTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC CCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACC TGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTT ATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC GGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTT GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAG
本產品僅供研究，不用于臨床診斷

上海研謹生物是一家專業(yè)從事生化試劑

、分子生物學試劑

、實驗耗材及實驗儀器研發(fā)、銷售

、服務為一體的專業(yè)性生物科技公司

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