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蛋白質(zhì)提取與純化技術(shù)
蛋白質(zhì)提取與純化技術(shù)
選擇材料及預(yù)處理
以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)
選擇材料及預(yù)處理
以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)
，從分子水平上認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向
，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)
。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理
、化學(xué)和生物等各方面知識(shí)，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于來(lái)同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。
微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。對(duì)于微生物，應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期
微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。對(duì)于微生物，應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期
，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期
，酶和核酸的含量較高
，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：
（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；
（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對(duì)動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進(jìn)行絞碎
（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；
（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對(duì)動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進(jìn)行絞碎
、脫脂等處理
。另外，對(duì)預(yù)處理好的材料
，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存
，對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。
蛋白質(zhì)的分離純化
一
蛋白質(zhì)的分離純化
一
，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取
大部分蛋白質(zhì)都可溶于水
大部分蛋白質(zhì)都可溶于水
、稀鹽、稀酸或堿溶液
，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇
、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中
，因些
，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。
（一）水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解
（一）水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解
。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定
。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大
，因此
，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間
。但另一方面
，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此
，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作
。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）
。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇
。
1、pH值
蛋白質(zhì)
1、pH值
蛋白質(zhì)
，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)
。用稀酸或稀堿提取時(shí)
，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化
，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)
，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取
，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。
2
2
、鹽濃度
稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶
稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶
，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合
，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)
，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾
。升濃度為宜
。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。
（二）有機(jī)溶劑提取法
一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶
（二）有機(jī)溶劑提取法
一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶
，不溶于水
、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中
，可用乙醇
、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性
，還有較強(qiáng)的親脂性
、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作
。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越
，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性
，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%
，40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活。另外
，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣
，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。
二
二
、蛋白質(zhì)的分離純化
蛋白質(zhì)的分離純化方法很多
蛋白質(zhì)的分離純化方法很多
，主要有：
（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法
1、蛋白質(zhì)的鹽析
中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響
（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法
1、蛋白質(zhì)的鹽析
中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響
，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高
，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶
；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)
，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析
，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中
，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。
影響鹽析的因素有：
（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行
影響鹽析的因素有：
（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行
。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低
。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白
、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低
，更容易鹽析。
（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低
（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低
。
（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)
（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)
，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋
，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%
。
蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽
蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽
，主要有硫酸銨、硫酸鎂
、硫酸鈉
、氯化鈉、磷酸鈉等
。 其中應(yīng)用最多的硫酸銨
，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升
；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M
，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)
，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)
；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性
。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間
，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。
蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。
2、等電點(diǎn)沉淀法
蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。
3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法
用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。
（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。
超濾法是利用高壓力或離心力
蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。
2、等電點(diǎn)沉淀法
蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。
3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法
用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。
（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。
超濾法是利用高壓力或離心力
，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上
，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)
。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析
，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離
蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。（詳見層析技術(shù)章）
（四）根據(jù)配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。
細(xì)胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度
（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離
蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。（詳見層析技術(shù)章）
（四）根據(jù)配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。
細(xì)胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度
。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織
、植物肉質(zhì)種子等。
2
2
、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中
，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)
，即可將細(xì)胞研碎
，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織
。
3
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、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂
，此法多適用于微生物材料
，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。
4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。
無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用
4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。
無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用
；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性
，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部
，還可通過選擇pH
、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取
。
濃縮
濃縮
、干燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀
，為了保存和鑒定的目的
，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：
1
1
、減壓加溫蒸發(fā)濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低
通過降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低
，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低
，蒸發(fā)愈快
，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2
2
、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮 空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液
，表面不斷通過空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室
，用電扇對(duì)準(zhǔn)吹風(fēng)
，使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的
，此法濃縮速度慢
，不適于大量溶液的濃縮。
3
3
、冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰
，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中，操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體
，然后緩慢地融解
，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí)
，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面
，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中
，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液
。
4
4
、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng)
，對(duì)生物大分子不吸附
，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇
，聚乙稀吡咯酮
、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時(shí)
，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里
，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去
，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積
。
5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方法
5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方法
，不液體在一定壓力下（氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^膜時(shí)
，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留
，這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法
，最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低
，操作方便
，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性
，回收率高等優(yōu)點(diǎn)
。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜
，水的流速
，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作需要來(lái)選用
。另外，超濾裝置形式
，溶質(zhì)成份及性質(zhì)
、溶液濃度等都對(duì)超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：
膜名稱 分子量截留值 孔的大的平均直徑
XM－300 300
膜名稱 分子量截留值 孔的大的平均直徑
XM－300 300
，000 140
XM－200 100
XM－200 100
，000 55
XM－50 50
XM－50 50
，000 30
PM－30 30，000 22
UM－20 20
PM－30 30，000 22
UM－20 20
，000 18
PM－10 10
PM－10 10
，000 15
UM－2 1，000 12
UM05 500 10
用上面的超濾膜制成空心的纖維管
UM－2 1，000 12
UM05 500 10
用上面的超濾膜制成空心的纖維管
，將很多根這樣的管攏成一束
，管的兩端與低離子強(qiáng)度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動(dòng)
。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中
。當(dāng)緩沖液流過纖維管時(shí)，則小分子很易透過膜而擴(kuò)散
，大分子則不能
。這就是纖維過濾秀析法，由于透析面積增大
，因而使透析時(shí)間縮短10倍
。
二、干燥
生物大分子制備得到產(chǎn)品
二、干燥
生物大分子制備得到產(chǎn)品
，為防止變質(zhì)
，易于保存，常需要干燥處理
，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥
。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存
，整個(gè)裝置包括干燥器
、冷凝器及真空干燥原理外，同時(shí)增加了溫度因素
。在相同壓力下
，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下
，冰很易升華為氣體
。操作時(shí)一般先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類生物大分子的干燥保存。
三、貯存
生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無(wú)明顯變化，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態(tài)貯藏時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性
三、貯存
生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無(wú)明顯變化，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態(tài)貯藏時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性
。
2
2
、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用的防腐劑有甲苯
、苯甲酸
、氯仿、百里酚等
。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊
、蔗糖、甘油等
，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性
。此外，鈣
、鋅
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、硼酸等溶液對(duì)某些酶也有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中
。
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、貯藏溫度要求低，大多數(shù)在0度左右冰箱保存
，有的則要求更低
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