可能影響酶免疫測定ELISA結(jié)果的標(biāo)本內(nèi)源性干擾因素

內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體

、高濃度的非特異免疫球蛋白

、異嗜性抗體、某些自身抗體

、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體

、交叉反應(yīng)物質(zhì)等

。在日常的臨床血清（漿）標(biāo)本中，有相當(dāng)比例不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì)

，從而導(dǎo)致測定結(jié)果的假陽性

。
1.類風(fēng)濕因子（rheumatoid factors,RF）在類風(fēng)濕患者、其他疾病以及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的RF

，RF一般為TgM型

，亦有IgG和IgA型

，RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點

，因為在ELISA測定中

，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果

。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現(xiàn)最為明顯，因為此時固相包被的抗體為抗人弘鏈抗體

，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。為避免RF對ELISA測定的干擾

，通?div id="4qifd00" class="flower right">

？梢圆扇∠率龃胧?br> (1)稀釋標(biāo)本：這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體如抗HAVIgM，抗HBclgM

， TORCH的IgM抗體檢驗等尤為有用。因為急性感染時

，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高

，而RF滴度通常相對要低得多

。因此

，在測定前對標(biāo)本進(jìn)行稀釋，特異的IgM因高滴度存在仍可檢出

，而非特異的RF則會因為稀釋變成非常低的滴度，從而對測定幾乎不產(chǎn)生干擾?div id="4qifd00" class="flower right">

，F(xiàn)在

，有些特異IgM檢測ELISA試劑盒不要求稀釋標(biāo)本

，直接檢測

，這樣雖然方便了實驗室技術(shù)人員的操作，但容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果

，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染

，血循環(huán)中抗HBelgM可持續(xù)以一定的滴度存在，標(biāo)本不做稀釋即進(jìn)行檢測

，即可出現(xiàn)陽性結(jié)果

，從而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的診斷價值

。因此

，在臨床實驗室

，一定要使用要求對標(biāo)本做1:1000稀釋的試劑盒進(jìn)行檢驗

，從而保證相應(yīng)檢測項目結(jié)果的可靠性及臨床應(yīng)用價值

。
(2)改變酶標(biāo)抗體：由于RF結(jié)合的是IgG的Fc片段，如果將待酶標(biāo)的抗體的F

，片段酶切夫除，僅留下具有特異結(jié)合功能的F(ab’)2部分標(biāo)記酶

，則在測定中即可避免RF的干擾

。
(3)標(biāo)本中RF用變性IgG預(yù)先封閉：將經(jīng)熱變性（63℃，10min）的動物如兔

、羊等的IgG加入到標(biāo)本稀釋液中，或是將該變性IgG連接至一顆粒固相如聚苯乙烯微球或微孔

，然后加入臨床血清標(biāo)本

，反應(yīng)后

，再吸出標(biāo)本進(jìn)行檢測

。此外，在測定特異IgM時

，也可使用抗人IgG去除臨床標(biāo)本中RF和IgG。
(4)測定抗原時

，可在標(biāo)本中加入可使RF降解的還原劑：如2—巰基乙醇

。2—巰基乙醇等還原劑可使抗體內(nèi)的巰基裂解，因而可以去除RF的干擾

，但只適用于抗原測定。
(5)包被或酶標(biāo)二抗使用特異的雞抗體IgY：RF不與雞IgY反應(yīng)

，如果包被和酶標(biāo)二抗均為雞IgY抗體，則不受標(biāo)本中RF的干擾

。
2.補(bǔ)體在固相酶免疫測定中

，來自哺乳動物的固相特異抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能

。一方面

，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因為其在固相吸附及結(jié)合過程中

，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，從而其F, 段的補(bǔ)體C1

，結(jié)合位點被暴露出來，這樣C1

，就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果

。另一方面

，固相抗體也會因為活化補(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力

，而引起假陽性結(jié)果或使定量測定結(jié)果偏低

。由補(bǔ)體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)對臨床血清標(biāo)本加熱滅活補(bǔ)體：采用56~C30min加熱可使標(biāo)本中的補(bǔ)體C1

。滅活

。
(2)包被或酶標(biāo)二抗使用特異的雞抗體：雞抗體不激活人的補(bǔ)體系統(tǒng)，因此

，使用特異的雞抗體

，不會出現(xiàn)因補(bǔ)體激活而存在的假陽性和假陰性干擾

。
3.異嗜性抗體（heterophilieantibodies）人類血清中含有抗嚙齒類動物（如鼠

、馬

、羊等）的免疫球蛋白（lg）的抗體

，即天然的異嗜性抗體。有研究表明

，天然的異嗜性抗體（lgG）可分為兩類

，一類（85%的假陽性由其引起）可結(jié)合于山羊

、小鼠

、大鼠

、馬和牛IgG的Fab區(qū)域

，但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結(jié)合于小鼠

、馬

、牛和兔IgG的Fc區(qū)表位，但不與山羊和大鼠IgG的Pc區(qū)表位結(jié)合

。異嗜性抗體可通過交聯(lián)固相和酶標(biāo)的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。由異嗜性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)使用特異的兔F(ab’)2

。片段作為固相或測定酶標(biāo)抗體

。
(2)在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig，封閉可能存在的異嗜性抗體

。但加入量不足或亞類不同時無效

。
(3)使用靶特異的非Ig親和蛋白（affibody）替代固相或酶標(biāo)抗體之一

。采用噬菌展示來自單個金黃色葡萄球A蛋白（SPA）聯(lián)合文庫的人IgA結(jié)合親和蛋白，用于IgA的測定

，不受異嗜性抗體的影響

。
4.因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體在臨床上，有嘗試使用鼠源性單克隆抗體進(jìn)行靶向治療

，及使用放射性核索標(biāo)記鼠源性單克隆抗體進(jìn)行影像診斷等

，均有可能使相應(yīng)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體。這種抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的酶免疫測定

，可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)使用的特異的抗體（F

，。bf）:片段作為固相或測定酶標(biāo)抗體

。
(2)在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的鼠Ig

，封閉可能存在的抗鼠抗體。
(3)使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體

。雞IgG不與人抗鼠抗體反應(yīng)

。因而

，用其作為固相或酶標(biāo)抗體不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果

。
5.自身抗體自身抗體如抗甲狀腺球蛋白

、抗胰島索等

，能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)果形成復(fù)合物，在ELISA方法中可干擾相應(yīng)原抗體的測定

。為避免以上情況出現(xiàn)

，可在測定前用理化方法將其解離。
6. 溶菌酶溶菌酶可與等電點較低的蛋白有強(qiáng)的結(jié)合能力

。免疫球蛋白等電點約為5

，因此

，在雙抗體夾心法ELISA測定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶標(biāo)的IgG間形成橋接

，從而導(dǎo)致假陽性

。因此，為保證ELISA測定的可靠性

，有必要從標(biāo)本中去除溶菌酶或?qū)⑵浞忾]

，Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶

，防止其連接IgG。
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