、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋?zhuān)?份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50μl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50μl/孔，然后再加入抗體工作液50μl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250μl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A液50μl/孔，再加入底物B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測(cè)定：加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，5min內(nèi)讀數(shù)），測(cè)定每孔OD值。
七

、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃妥因代謝物量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.04pb為1.816；0.12ppb為1.415；0.36ppb為0.74；1.08ppb為0.313；3.24ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是1.08ppb～3.24ppb；樣本2的濃度范圍是0.12ppb～0.36ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物實(shí)際濃度。
2

、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝	B	×100%
	B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來(lái)電索取）
八