多酚氧化酶（polyphenol oxidase
，PPO）試劑盒說明書

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動(dòng)物

、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中

，是一種含銅的氧化酶

，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化

，與果蔬加工

、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。
測定原理：
PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌

，后者在 525nm有特征光吸收

。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)

、水浴鍋

、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽

、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：100mL×1 瓶

，4℃保存

；試劑一：20mL×1 瓶，4℃保存

；試劑二：5mL×1 瓶

，4℃保存；試劑三：10mL×1 瓶

，4℃保存；
粗酶液提?div id="jfovm50" class="index-wrap">。?br> 1

、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)

，離心后棄上清

；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴

，功率 20％或200W，超聲3s

，間隔10s

，重復(fù)30次）；8000g 4℃ 離心10min

，取上清

，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織

，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿

。8000g 4℃離心10min

，取上清，置冰上待測

。
2

、血清（漿）或果汁樣本的處理：
按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清
（漿）或果汁加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿

。8000g 4℃離心10min

，取上清，置冰上待測

。

測定步驟：
1

、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至525nm

，蒸餾水調(diào)零

。
2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）

試劑名稱（μL）	測定管	對(duì)照管
試劑一	200	200
試劑二	50	50
樣本	50
煮沸的樣本		50

37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴10min 后迅速放入冰浴中冷卻

試劑三

100

充分混勻

，10000g，常溫離心10min

，收集上清

，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm 處檢測測定管和對(duì)照管吸光度

，計(jì)算 ΔA=A測定-A對(duì)照

。
注意：每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管

?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">？梢栽诓煌瑢?duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行 1min 沸水浴處理

。
PPO 活性計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下1

、血清（漿）或果汁PPO活性
單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01 為一個(gè)酶活力單位

。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷V 液
2

、組織

、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位

。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =80×ΔA÷Cpr 此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位

。PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位

。
PPO（U/104cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.16×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.4mL

；V 液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL

；V 樣：加入樣本體積

，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積

，1 mL

；T：反應(yīng)時(shí)間

，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度

，mg/mL；W：樣本質(zhì)量

，g

；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬

。

b. 用96孔板測定的計(jì)算公式如下1

、血清（漿）或果汁PPO活性
單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005 為一個(gè)酶活力單位。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷V 液
2

、組織

、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單位

。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =160×ΔA÷Cpr 此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度

。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單位。
PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位

。
PPO（U/104cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =0.32×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積

，0.4mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積

，0.1mL； V 樣：加入樣本體積

，0.05mL

；V 樣總：加入提取液體積，1 mL

；T：反應(yīng)時(shí)間

，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度

，mg/mL

；W：樣本質(zhì)量，g

；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)

，500 萬。