線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說明書

線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說明書

微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶

，廣泛存在于動(dòng)物、植物

、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物

。該酶催化一對(duì)電子從NADH 傳遞給CoQ

，同時(shí)可使O₂還原生成O^2.-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O^2.-的主要部位

。測(cè)定該酶活性

，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)

，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)

。
測(cè)定原理
復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成 NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小

。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)

、水浴鍋

、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板

、研缽

、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：液體 100mL×1 瓶

，-20℃保存

；
試劑二：液體 20mL×1 瓶，-20℃保存

；
試劑三：液體 1.5mL×1 瓶

，-20℃保存

；
試劑四：液體 25mL×1 瓶

，-20℃保存；
試劑五：液體 1mL×1 支

，-20℃保存

；
試劑六：粉劑×1 支

，-20℃保存

，用時(shí)加入2mL蒸餾水，現(xiàn)配現(xiàn)用

。
工作液的配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解

；現(xiàn)配現(xiàn)用；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞

，加入1mL試劑一和10uL試劑三

，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g

，4℃離心 5min

。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中

，11000g

，4℃離心10min

。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白

，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體

，加入200uL試劑二和2uL試劑三

，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W

，超聲3s，間隔10秒

，重復(fù)30次）

，用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1

、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上

，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零

。
2

、樣本測(cè)定
（1）工作液于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min

。
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六

，混勻

，記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2

。
復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T
=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度

。
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)
÷T=365×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位

。
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10^-4L

；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm

；d：比色皿光徑

，1cm；V 樣：加入樣本體積

，0.01 mL

；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL

；T：反應(yīng)時(shí)間

，2 min；W：樣本質(zhì)量

，g

；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬

。
b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T
=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度

。
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位

。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)
÷T=730×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位

。
復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積

，2.25×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)

，6.22×10³L/mol/cm

；d：96孔板光徑，0.5cm

；V 樣：加入樣本體積

，0.01 mL

；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL

；
T：反應(yīng)時(shí)間

，2 min；W：樣本質(zhì)量

，g

；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬

。