線粒體復合體Ⅱ試劑盒說明書
微量法
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
線粒體復合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶
，廣泛存在于動物
、植物
、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中
，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時輔基FAD還原為FADH
2，后者進一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q
，是呼吸電子傳遞鏈的支路。
測定原理：
復合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進一步還原2,6-二氯吲哚酚
，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰
，通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計算該酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀
、臺式離心機
、水浴鍋、可調(diào)式移液器
、微量石英比色皿/96 孔板
、研缽、冰和蒸餾水
。
試劑組成和配制：
試劑一：液體 50mL×1 瓶
，-20℃保存；
試劑二：液體 10mL×1 瓶
，-20℃保存
；
試劑三：液體 0.75mL×1 支，-20℃保存
；
試劑四：液體 12.5mL×1 瓶
，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支
，-20℃保存
；
試劑六：液體 1.25mL×1 瓶，4℃保存
；
樣本的前處理：
組織
、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1
、準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三
，用冰浴勻漿器或研缽勻漿
。
2、將勻漿 600g
，4℃離心5min
。
3、棄沉淀
，將上清液移至另一離心管中
，11000g，4℃離心10min
。
4
、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅱ（此步可選做）
。
5
、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三
，超聲波破碎（冰浴
，功率20％或200W，超聲3s
，間隔10秒
，重復30次），用于復合體Ⅱ酶活性測定
。
測定步驟：
1
、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至605nm
，蒸餾水調(diào)零
。
2、樣本測定
（1）工作液的配制：臨用前把試劑五轉移到試劑四中混合溶解
，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min
；用不完的試劑4℃可保存一周；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本
、25μL試劑六和200μL工作液，立即混勻
，記錄605nm處初始吸光值A1和2min后的吸光值A2
，計算ΔA=A1-A2。
復合體Ⅱ活力單位的計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位
。
復合體Ⅱ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10
9]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度
。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位
。
復合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10
9]÷(W× V樣÷V樣總)
÷T=113×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅱ活力(nmol/min/10
4cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10
9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA
V 反總：反應體系總體積
，2.35×10
-4 L
；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10
4 L/ mol /cm
；d：比色皿光徑
，1cm；V 樣：加入樣本體積
，0.01 mL
；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL
；T：反應時間
，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度
，mg/mL
；W：樣本質(zhì)量，g
；500：細胞或細菌總數(shù)
，500 萬。
b.使用96孔板測定的計算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位
。
復合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10
9]÷(Cpr×V樣) ÷T
=1118×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度
。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10
9]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=226×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位
。
復合體Ⅱ活力(nmol/min/10
4cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10
9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.452×ΔA
V 反總：反應體系總體積
，2.35×10
-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)
，2.1×10
4 L/ mol /cm
；d：96 孔板光徑，0.5cm
；V 樣：加入樣本體積
，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積
，0.202mL
；T：反應時間，2 min
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