；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應用DAB溶液（試劑F）顯色；
15.復染：自來水充分沖洗，復染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項：
1. 修復后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導致結晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會影響結果觀察。
5. 如須復染細胞核，則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。
附1：
抗原修復方法
常用抗原修復液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA抗原修復液（pH8.0或9.0）等等。
一